Применение открытых поисковых подходов к идентификации Acinetobacter baumannii O-сцепленных гликопептидов

Белковое гликозилирование, процесс присоединения углеводов к белковым молекулам, является одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций (ПТМ) в природе ^1,2. Во всех областях жизни развился ряд сложных механизмов, предназначенных для генерации гликопротеинов, которые влияют на множество клеточных функций 1,3,4,5. В то время как гликозилирование белка происходит на диапазоне аминокислот ^6,7, N-связанные и O-связанные события гликозилирования являются двумя доминирующими формами, наблюдаемыми в природе. N-связанное гликозилирование включает присоединение гликанов к атому азота остатков аспарагина (Asn), в то время как при O-связанном гликозилировании гликокислоты присоединяются к атому кислорода остатков серина (Ser), треонина (Thr) или тирозина (Tyr)⁷. Несмотря на сходство в остатках, на которые нацелены системы гликозилирования, различия в гликанах, прикрепленных к белкам, приводят к тому, что гликозилирование является наиболее химически разнообразным классом ПТМ, обнаруженных в природе.

В то время как системы эукариотического гликозилирования обладают гликанцевым разнообразием, эти системы, как правило, ограничены в количестве используемых уникальных углеводов. Полученное разнообразие связано с тем, как эти углеводы распределены в^{гликаны} 8,9,10,11,12. Напротив, бактериальные и архейные виды обладают практически неограниченным разнообразием гликанов из-за огромного количества уникальных сахаров, образующихся в этих системах ^{2,10,13,14,15,16,17}. Эти различия в разнообразии гликанов, наблюдаемые в разных областях жизни, представляют собой значительную аналитическую проблему для характеристики и идентификации событий гликозилирования. Для эукариотического гликозилирования способность предвидеть гликовые композиции способствовала росту интереса к гликобиологии; тем не менее, то же самое не относится к бактериальному гликозилированию, которое по-прежнему в значительной степени ограничено изучением специализированными лабораториями. Поскольку доступность приборов масс-спектрометрии (МС) возросла в биологических науках, подходы, основанные на МС, в настоящее время являются основным методом гликопротеомного анализа.

РС стал квинтэссенцией инструмента для характеристики гликозилирования, причем как нисходящий, так и восходящий подходы в настоящее время широко используются для характеристики гликопротеинов⁶. В то время как нисходящая протеомика используется для оценки глобальных паттернов гликозилирования специфических белков ^18,19, подходы «снизу вверх» используются для обеспечения гликан-специфической характеристики гликопептидов даже из сложных смесей 6,20,21,22,23. Для анализа гликопептидов генерация информативной информации о фрагментации имеет важное значение для характеристики событий гликозилирования^24,25. В настоящее время на приборах обычно доступен ряд подходов к фрагментации, включая диссоциацию, вызванную столкновением на основе резонансной ионной ловушки (IT-CID), диссоциацию, вызванную столкновением пучка (CID), и диссоциацию переноса электронов (ETD). Каждый подход обладает различными сильными и слабыми сторонами для анализа гликопептидов^25,26, со значительным прогрессом за последнее десятилетие в применении этих подходов к фрагментации для анализа гликозилирования ^6,20. Однако для анализа бактериального гликозилирования критическим ограничением была не способность фрагментировать гликопептиды, а скорее неспособность предсказать потенциальные составы гликанов в образцах. В этих системах неизвестная природа разнообразных бактериальных гликанов ограничивает идентификацию гликопептидов, даже с помощью инструментов поиска, ориентированных на гликозилирование, которые в настоящее время являются обычным явлением для анализа эукариотических гликопептидов, таких как O-Pair²⁷, GlycopeptideGraphMS²⁸ и GlycReSoft²⁹. Чтобы преодолеть эту проблему, требуется альтернативный метод поиска с использованием открытых поисковых инструментов, возникающих в качестве мощного подхода к изучению бактериального гликозилирования³⁰.

Открытый поиск, также известный как слепой или подстановочный поиск, позволяет идентифицировать пептиды с неизвестными или неожиданными PTM 21,30,31,32. Открытый поиск использует различные вычислительные методы, включая кураторский поиск модификаций, многошаговый поиск по базе данных или широкомасштабный толерантный поиск ^{33,34,35,36,37}. Хотя открытый поиск имеет большой потенциал, его использование, как правило, затрудняется значительным увеличением времени анализа и потерей чувствительности обнаружения немодифицированных пептидов по сравнению с ограниченными поисками^31,32. Снижение обнаружения немодифицированных пептидно-спектральных совпадений (PSM) является результатом увеличения частоты ложноположительных PSM, связанных с этими методами, что требует усиленной строгой фильтрации для поддержания желаемых показателей ложного обнаружения (FDR)33,34,35,36,37 . В последнее время стало доступно несколько инструментов, которые значительно улучшают доступность открытого поиска, в том числе Byonic^31,38, Open-pFind³⁹, ANN-SoLo⁴⁰ и MSFragger^21,41. Эти инструменты позволяют надежно идентифицировать события гликозилирования за счет значительного сокращения времени анализа и реализации подходов к обработке гетерогенных гликановых композиций.

В данной статье представлен упрощенный метод идентификации бактериальных гликопептидов путем открытого поиска с использованием в качестве модели грамотрицательного внутрибольничного патогена Acinetobacter baumannii. A. baumannii обладает сохраненной O-связанной системой гликозилирования, ответственной за модификацию нескольких белковых субстратов, известной как система гликозилирования белка PglL 42,43,44. В то время как подобные белки нацелены на гликозилирование между штаммами, система гликозилирования PglL сильно варьируется из-за биосинтеза гликана, используемого для гликозилирования белка, полученного из локуса капсулы (известного как K-локус)44,45,46. Это приводит к тому, что различные гликаны (также известные как K-единица), полученные из одиночных или ограниченных полимеризованных K-единиц, добавляются к белковым субстратам 30,44,46. В рамках этой работы использование инструмента открытого поиска MSfragger в программном обеспечении FragPipe используется для идентификации гликанов в штаммах A. baumannii. Сочетая открытый поиск и ручное курирование, можно предпринять «гликано-ориентированные поиски» для дальнейшего улучшения идентификации бактериальных гликопептидов. В совокупности этот многоступенчатый подход к идентификации позволяет идентифицировать гликопептиды без обширного опыта в характеристике новых событий гликозилирования.