基于开放搜索的方法在 鲍曼不动杆菌 O-连锁糖肽鉴定中的应用

蛋白质糖基化是将碳水化合物附着在蛋白质分子上的过程，是自然界中最常见的翻译后修饰（PTMs）^之一1，2。在生命的所有领域，一系列复杂的机器已经进化出来，致力于产生糖蛋白，影响无数的细胞功能^{1，3，4，5}。虽然蛋白质糖基化发生在一系列氨基酸^6，7上， 但N-连接和 O-链接糖基化事件是自然界中观察到的两种主要形式。 N-连锁糖基化涉及聚糖连接到天冬酰胺（Asn）残基的氮原子上，而在 O-连锁糖基化中，聚糖连接到丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）残基⁷的氧原子上。尽管糖基化系统所针对的残基相似，但附着在蛋白质上的聚糖内部的差异导致糖基化是自然界中发现的化学多样性最高的PTM类。

虽然真核糖基化系统具有聚糖多样性，但这些系统通常被限制使用的独特碳水化合物的数量。由此产生的多样性源于这些碳水化合物如何排列成聚糖^8，9，^10，11，12。相比之下，细菌和古菌物种具有几乎无限的聚糖多样性，因为这些系统内产生的独特糖阵列^{2，10，13，14，15，16，17}。在生命领域观察到的聚糖多样性的这些差异代表了糖基化事件的表征和鉴定的重大分析挑战。对于真核糖基化，预测聚糖组成的能力促进了对糖生物学日益增长的兴趣;然而，细菌糖基化的情况并非如此，它仍然在很大程度上局限于由专业实验室进行研究。随着质谱（MS）仪器在生物科学中的可及性增加，基于MS的方法现在是糖蛋白组学分析的主要方法。

MS已成为表征糖基化的典型工具，现在通常使用自上而下和自下而上的方法来表征糖蛋白⁶。虽然自上而下的蛋白质组学用于评估特定蛋白质的全局糖基化模式^18，19，但自下而上的方法用于实现糖肽的聚糖特异性表征，即使来自复杂的混合物^6，20，^21，22，23。对于糖肽的分析，信息片段化信息的产生对于糖基化事件的表征^{至关重要24，25}。现在，仪器上通常可以使用一系列碎片化方法，包括基于共振离子阱的碰撞诱导解离（IT-CID），光束型碰撞诱导解离（CID）和电子转移解离（ETD）。每种方法在糖肽分析方面具有不同的优点和缺点^25，26，在过去的十年中，在应用这些片段化方法分析糖基化方面取得了重大进展^6，20。然而，对于细菌糖基化分析，关键限制不是片段糖肽的能力，而是无法预测样品中潜在的聚糖组成。在这些系统中，多种细菌聚糖的未知性质限制了糖肽的鉴定，即使使用以糖基化为重点的搜索工具现在在真核糖肽的分析中也很常见，例如O-Pair²⁷，GlycopeptideGraphMS²⁸和GlycReSoft²⁹。为了克服这个问题，需要一种替代的搜索方法，使用开放搜索工具成为研究细菌糖基化³⁰的强大方法。

开放搜索，也称为盲或通配符搜索，允许识别具有未知或意外PTMs^{21，30，31，32}的肽。开放搜索利用各种计算技术，包括精选修改搜索、多步数据库搜索或宽质量容忍搜索^{33、34、35、36、37}。尽管开放搜索具有巨大的潜力，但与限制搜索相比，其使用通常受到分析时间的显着增加和未修饰肽检测灵敏度损失^{的阻碍31，32}。未修饰肽光谱匹配（PSM）检测的减少是与这些技术相关的假阳性PSM率增加的结果，这需要增加严格的过滤以保持所需的错误发现率（FDR）^{33，34，35，36，37}.最近，已经出现了几种工具，可以显着提高开放搜索的可访问性，包括Byonic^31，38，Open-pFind³⁹，ANN-SoLo⁴⁰和MSFragger^21，41。这些工具通过显著缩短分析时间并实施处理异质聚糖组合物的方法，能够可靠地鉴定糖基化事件。

本文提出了一种通过开放搜索鉴定细菌糖肽的简化方法，以革兰氏阴性院内病原体鲍曼不动杆菌为模型。鲍曼尼具有保守的O-连接糖基化系统，负责修饰多种蛋白质底物，称为PglL蛋白质糖基化系统^42，43，44。虽然类似的蛋白质是菌株之间糖基化的目标，但由于用于蛋白质糖基化的聚糖的生物合成来自胶囊位点（称为K-位点）^44，45，46，^PglL糖基化系统是高度可变的。这导致来自单个或有限聚合K单元的多种聚糖（也称为K单元）被添加到蛋白质底物^30，44，46中。在这项工作中，使用开放搜索工具MSfragger，在软件FragPipe中，用于鉴定鲍曼氏菌菌株中的聚糖。通过结合开放搜索和手动管理，可以进行“聚糖重点搜索”，以进一步改善细菌糖肽的鉴定。总之，这种多步骤鉴定方法能够在没有丰富经验的新型糖基化事件表征方面鉴定糖肽。