L’application d’approches basées sur la recherche ouverte pour l’identification des glycopeptides liés à L’O d’Acinetobacter baumannii

La glycosylation des protéines, le processus de fixation des glucides aux molécules de protéines, est l’une des modifications post-traductionnelles (PTM) les plus courantes dans la nature ^1,2. Dans tous les domaines de la vie, une gamme de machines complexes a évolué dédiée à la génération de glycoprotéines qui ont un impact sur une myriade de fonctions cellulaires 1,3,4,5. Alors que la glycosylation des protéines se produit sur une gamme d’acides aminés ^6,7, les événements de glycosylation liés à l’azote et à l’O sont deux formes dominantes observées dans la nature. La glycosylation liée à l’azote implique la fixation des glycanes à un atome d’azote de résidus d’asparagine (Asn), tandis que dans la glycosylation liée à l’O, les glycanes sont attachés à un atome d’oxygène de résidus de sérine (Ser), de thréonine (Thr) ou de tyrosine (Tyr)⁷. Malgré les similitudes dans les résidus ciblés par les systèmes de glycosylation, les différences au sein des glycanes attachés aux protéines font de la glycosylation la classe de PTM la plus chimiquement diversifiée trouvée dans la nature.

Alors que les systèmes de glycosylation eucaryotes possèdent une diversité de glycanes, ces systèmes sont généralement limités dans le nombre de glucides uniques utilisés. La diversité résultante provient de la façon dont ces glucides sont disposés en glycanes 8,9,10,11,12. En revanche, les espèces bactériennes et archéales possèdent une diversité de glycanes pratiquement illimitée en raison de la vaste gamme de sucres uniques générés dans ces systèmes ^{2,10,13,14,15,16,17}. Ces différences dans la diversité des glycanes observées dans les domaines de la vie représentent un défi analytique important pour la caractérisation et l’identification des événements de glycosylation. Pour la glycosylation eucaryote, la capacité d’anticiper les compositions de glycanes a facilité l’intérêt croissant pour la glycobiologie; pourtant, il n’en va pas de même pour la glycosylation bactérienne, qui est encore largement limitée à l’étude par des laboratoires spécialisés. Comme l’accessibilité de l’instrumentation de spectrométrie de masse (SEP) a augmenté dans les biosciences, les approches basées sur la SEP sont maintenant la principale méthode d’analyse glycoprotéomique.

La SEP est devenue l’outil par excellence pour la caractérisation de la glycosylation, avec des approches descendantes et ascendantes maintenant couramment utilisées pour caractériser les glycoprotéines⁶. Alors que la protéomique descendante est utilisée pour évaluer les modèles globaux de glycosylation de protéines spécifiques^18,19, des approches ascendantes sont utilisées pour permettre la caractérisation spécifique des glycanes des glycopeptides, même à partir de mélanges complexes ^{6,20,21,22,23}. Pour l’analyse des glycopeptides, la génération d’informations de fragmentation informatives est essentielle pour la caractérisation des événements de glycosylation^24,25. Une gamme d’approches de fragmentation est maintenant couramment accessible sur les instruments, y compris la dissociation induite par collision basée sur un piège à ions de résonance (IT-CID), la dissociation induite par collision de type faisceau (CID) et la dissociation par transfert d’électrons (ETD). Chaque approche possède des forces et des faiblesses différentes pour l’analyse des glycopeptides^25,26, avec des progrès significatifs au cours de la dernière décennie dans l’application de ces approches de fragmentation pour analyser la glycosylation ^6,20. Cependant, pour l’analyse de la glycosylation bactérienne, la limitation critique n’a pas été la capacité de fragmenter les glycopeptides, mais plutôt l’incapacité de prédire les compositions potentielles de glycanes dans les échantillons. Au sein de ces systèmes, la nature inconnue de divers glycanes bactériens limite l’identification des glycopeptides, même avec des outils de recherche axés sur la glycosylation maintenant courants pour l’analyse des glycopeptides eucaryotes, tels que O-Pair²⁷, GlycopeptideGraphMS²⁸ et GlycReSoft²⁹. Pour surmonter ce problème, une méthode de recherche alternative est nécessaire, l’utilisation d’outils de recherche ouverts émergeant comme une approche puissante pour l’étude de la glycosylation bactérienne³⁰.

La recherche ouverte, également connue sous le nom de recherche à l’aveugle ou à caractère générique, permet d’identifier des peptides avec des PTM inconnus ou inattendus ^21,30,31,32. Les recherches ouvertes utilisent une variété de techniques de calcul, y compris les recherches de modification organisées, les recherches dans les bases de données en plusieurs étapes ou la recherche tolérante à grande masse ^{33,34,35,36,37}. Bien que la recherche ouverte ait un grand potentiel, son utilisation a généralement été entravée par l’augmentation significative des temps d’analyse et la perte de sensibilité de la détection de peptides non modifiés par rapport aux recherches restreintes^31,32. La diminution de la détection des correspondances peptide-spectrales (MSP) non modifiées est le résultat de l’augmentation des taux de PSM faussement positifs associés à ces techniques, ce qui nécessite un filtrage rigoureux accru pour maintenir les taux de fausse découverte (FDR) souhaités 33,34,35,36,37 . Récemment, plusieurs outils sont devenus disponibles qui améliorent considérablement l’accessibilité de la recherche ouverte, notamment Byonic ^31,38, Open-pFind³⁹, ANN-SoLo⁴⁰ et MSFragger^21,41. Ces outils permettent l’identification robuste des événements de glycosylation en réduisant considérablement les temps d’analyse et en mettant en œuvre des approches pour gérer les compositions de glycanes hétérogènes.

Cet article présente une méthode simplifiée pour l’identification des glycopeptides bactériens par recherche ouverte, en utilisant l’agent pathogène nosocomial à Gram négatif, Acinetobacter baumannii, comme modèle. A. baumannii possède un système de glycosylation lié à l’O conservé responsable de la modification de multiples substrats protéiques, connu sous le nom de système de glycosylation de la protéine PglL 42,43,44. Alors que des protéines similaires sont ciblées pour la glycosylation entre les souches, le système de glycosylation PglL est très variable en raison de la biosynthèse du glycane utilisé pour la glycosylation des protéines dérivé du locus de la capsule (connu sous le nom de K-locus)44,45,46. Il en résulte que divers glycanes (également connus sous le nom d’unité K), dérivés d’unités K polymérisées simples ou limitées, sont ajoutés aux substrats protéiques 30,44,46. Dans ce travail, l’utilisation de l’outil de recherche ouvert, MSfragger, dans le logiciel FragPipe, est utilisée pour identifier les glycanes à travers les souches d’A. baumannii. En combinant la recherche ouverte et la curation manuelle, des « recherches axées sur le glycane » peuvent être entreprises pour améliorer davantage l’identification des glycopeptides bactériens. Ensemble, cette approche d’identification en plusieurs étapes permet l’identification de glycopeptides sans expérience approfondie dans la caractérisation de nouveaux événements de glycosylation.