概要

Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati

Published: August 10, 2021
doi:

概要

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostituzione dell’attività di estrazione di Msp1 con componenti completamente purificati in proteolipolisi definiti.

Abstract

Come centro per la fosforilazione ossidativa e la regolazione apoptotica, i mitocondri svolgono un ruolo vitale nella salute umana. La corretta funzione mitocondriale dipende da un robusto sistema di controllo della qualità per mantenere l’omeostasi proteica (proteostasi). Il declino della proteostasi mitocondriale è stato collegato al cancro, all’invecchiamento, alla neurodegenerazione e a molte altre malattie. Msp1 è un’ATPasi AAA+ ancorata nella membrana mitocondriale esterna che mantiene la proteostasi rimuovendo le proteine non localizzate ancorate alla coda. Utilizzando componenti purificati ricostituiti in proteoliposomi, abbiamo dimostrato che Msp1 è necessario e sufficiente per estrarre una proteina modello ancorata alla coda da un doppio strato lipidico. Il nostro sistema ricostituito semplificato supera molte delle barriere tecniche che hanno ostacolato lo studio dettagliato dell’estrazione delle proteine di membrana. Qui, forniamo metodi dettagliati per la generazione di liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione Msp1.

Introduction

La corretta funzione cellulare dipende da un processo chiamato proteostasi, che assicura che le proteine funzionali siano alla corretta concentrazione e posizione cellulare1. I fallimenti nella proteostasi portano a compromissione della funzione degli organelli e sono associati a molte malattie neurodegenerative2,3,4. Le proteine di membrana presentano sfide uniche per la rete di proteostasi in quanto devono essere mirate alla membrana corretta evitando l’aggregazione dai domini transmembrana idrofobici (TMD)5. Di conseguenza, macchinari specializzati si sono evoluti per proteggere la TMD idrofobica dal citosol e facilitare il targeting e l’inserimento nella corretta membrana cellulare6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.

I mitocondri sono il fulcro metabolico della cellula e sono coinvolti in numerosi processi cellulari essenziali quali: fosforilazione ossidativa, generazione di cluster ferro-zolfo e regolazione apoptotica16,17. Questi organelli endosimbiotici contengono due membrane, denominate membrana mitocondriale interna (IMM) e membrana mitocondriale esterna (OMM). Oltre il 99% delle 1.500 proteine mitocondriali umane sono codificate nel genoma nucleare e devono essere traslocate attraverso una o due diverse membrane18,19. La corretta funzione mitocondriale dipende quindi da una robusta rete di proteostasi per correggere eventuali errori nel targeting o nella traslocazione delle proteine.

Il nostro laboratorio si concentra su un sottoinsieme di proteine di membrana mitocondriale chiamate proteine ancorate alla coda (TA), che hanno un singolo dominio transmembrana al C-terminus20,21,22,23,24. Le proteine TA sono coinvolte in una serie di processi essenziali, come l’apoptosi, il trasporto delle vescicole e la traslocazione delle proteine25. La topologia unica delle proteine TA richiede l’inserimento post-traduzionale, che avviene nel reticolo endoplasmatico (ER) da parte del Guided Entry of Tail-anchored (GET) o delle vie EMC (EMC) del reticolo endoplasmatico o nell’OMM da una via scarsamente caratterizzata20,26,27,28. Le proprietà biofisiche della TMD sono necessarie e sufficienti per guidare le proteine TA alla corretta membrana29. Il riconoscimento delle caratteristiche biofisiche piuttosto che di un motivo di sequenza definito limita la fedeltà delle vie di targeting5. Pertanto, l’errata localizzazione delle proteine TA è uno stress comune per le reti di proteostasi. Lo stress cellulare, come l’inibizione della via GET, provoca un aumento della mislocalizzazione proteica all’OMM e disfunzione mitocondriale a meno che queste proteine non vengano prontamente rimosse30,31.

Un tema comune nella proteostasi di membrana è l’uso di proteine AAA+(ATPasi Associate con attività cellulari A)per rimuovere proteine vecchie, danneggiate o mal localizzate dal doppio strato lipidico1,32,33,34,35,36,37,38 . Le proteine AAA+ sono motori molecolari che formano anelli esamerici e subiscono movimenti dipendenti dall’ATP per rimodellare un substrato, spesso per traslocazione attraverso uno stretto poro assiale39,40. Sebbene grande sforzo sia stato dedicato allo studio dell’estrazione di proteine di membrana da parte delle ATPasi AAA+, le ricostituzioni sono complesse o coinvolgono una miscela di lipidi e detergente41,42,che limita il potere sperimentale di esaminare il meccanismo di estrazione del substrato dal doppio strato lipidico.

Msp1 è un’ATPasi AAA+ altamente conservata ancorata nell’OMM e nei perossisomi che svolge un ruolo critico nella proteostasi di membrana rimuovendo le proteine TA43, 44,45,46,47,erroneamente non localizzate. Msp1 ha anche recentemente dimostrato di alleviare lo stress da importazione di proteine mitocondriali rimuovendo le proteine di membrana che si bloccano durante la traslocazione attraverso l’OMM48. La perdita di Msp1 o dell’omologo umano ATAD1 provoca frammentazione mitocondriale, fallimenti nella fosforilazione ossidativa, convulsioni, aumento delle lesioni a seguito di ictus e morte precoce31,49,50,51,52,53,54,55,56.

Abbiamo dimostrato che è possibile co-ricostituire le proteine TA con Msp1 e rilevare l’estrazione dal doppio strato lipidico57. Questo sistema semplificato utilizza proteine completamente purificate ricostituite in liposomi definiti che imitano l’OMM (Figura 1)58,59. Questo livello di controllo sperimentale può affrontare dettagliate questioni meccanicistiche di estrazione del substrato che sono sperimentalmente intrattabili con ricostituzioni più complesse che coinvolgono altre proteine AAA +. Qui, forniamo protocolli sperimentali che descrivono in dettaglio i nostri metodi per la preparazione dei liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione. La nostra speranza è che questi dettagli sperimentali facilitino ulteriori studi sul processo essenziale ma poco compreso della proteostasi di membrana.

Protocol

1. Preparazione dei liposomi Combinare le scorte di cloroformio dei lipidi in rapporti appropriati per imitare la membrana mitocondriale esterna. Preparare 25 mg di miscela lipidica. Utilizziamo una miscela precedentemente stabilita di lipidi che imitano le membrane mitocondriali, costituita da un rapporto molare 48:28:10:10:4 di fosfatidilcolina (PC) uovo di gallina, fosfatidil etanolammina (PE) dell’uovo di gallina, fosfatidil-inositolo (PI) del fegato bovino, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina …

Representative Results

Per interpretare correttamente i risultati, il gel antimacchia e il western blot devono essere visti insieme. Il gel antimacchia garantisce un carico uguale su tutti i campioni. Quando si visualizza il gel antimacchia, gli accompagnatori (GST-calmodulina e GST-SGTA) saranno visibili nelle corsie INPUT (I) ed ELUTE (E). Ricontrollare che l’intensità di queste bande sia uniforme su tutti i campioni INPUT. Allo stesso modo, assicurarsi che l’intensità sia uniforme tra i campioni ELUTE. L’ELUTE è 5 volte più concentrato …

Discussion

La corretta funzione mitocondriale dipende da un robusto sistema di controllo della qualità delle proteine. A causa dei limiti intrinseci nella fedeltà delle vie di targeting delle proteine TA, le proteine TA mal localizzate sono una fonte costante di stress per i mitocondri. Un componente chiave della rete di proteostasi mitocondriale è Msp1, che è una membrana ancorata AAA + ATPasi che rimuove le proteine TA mal localizzate dall’OMM. Qui, abbiamo descritto come preparare i proteoliposomi, co-ricostituire Msp1 e una…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLW ha sviluppato parte di questo protocollo durante i suoi studi post-dottorato con il Dr. Robert Keenan presso l’Università di Chicago.

Questo lavoro è finanziato dalla sovvenzione NIH 1R35GM137904-01 a MLW.

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017

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記事を引用
Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).

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