Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati

La corretta funzione cellulare dipende da un processo chiamato proteostasi, che assicura che le proteine funzionali siano alla corretta concentrazione e posizione cellulare¹. I fallimenti nella proteostasi portano a compromissione della funzione degli organelli e sono associati a molte malattie neurodegenerative^2,3,4. Le proteine di membrana presentano sfide uniche per la rete di proteostasi in quanto devono essere mirate alla membrana corretta evitando l’aggregazione dai domini transmembrana idrofobici (TMD)⁵. Di conseguenza, macchinari specializzati si sono evoluti per proteggere la TMD idrofobica dal citosol e facilitare il targeting e l’inserimento nella corretta membrana cellulare^{6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.}

I mitocondri sono il fulcro metabolico della cellula e sono coinvolti in numerosi processi cellulari essenziali quali: fosforilazione ossidativa, generazione di cluster ferro-zolfo e regolazione apoptotica^16,17. Questi organelli endosimbiotici contengono due membrane, denominate membrana mitocondriale interna (IMM) e membrana mitocondriale esterna (OMM). Oltre il 99% delle 1.500 proteine mitocondriali umane sono codificate nel genoma nucleare e devono essere traslocate attraverso una o due diverse membrane^18,19. La corretta funzione mitocondriale dipende quindi da una robusta rete di proteostasi per correggere eventuali errori nel targeting o nella traslocazione delle proteine.

Il nostro laboratorio si concentra su un sottoinsieme di proteine di membrana mitocondriale chiamate proteine ancorate alla coda (TA), che hanno un singolo dominio transmembrana al C-terminus^{20,21,22,23,24.} Le proteine TA sono coinvolte in una serie di processi essenziali, come l’apoptosi, il trasporto delle vescicole e la traslocazione delle proteine²⁵. La topologia unica delle proteine TA richiede l’inserimento post-traduzionale, che avviene nel reticolo endoplasmatico (ER) da parte del Guided Entry of Tail-anchored (GET) o delle vie EMC (EMC) del reticolo endoplasmatico o nell’OMM da una via scarsamente caratterizzata^20,26,27,28. Le proprietà biofisiche della TMD sono necessarie e sufficienti per guidare le proteine TA alla corretta membrana^29. Il riconoscimento delle caratteristiche biofisiche piuttosto che di un motivo di sequenza definito limita la fedeltà delle vie di targeting⁵. Pertanto, l’errata localizzazione delle proteine TA è uno stress comune per le reti di proteostasi. Lo stress cellulare, come l’inibizione della via GET, provoca un aumento della mislocalizzazione proteica all’OMM e disfunzione mitocondriale a meno che queste proteine non vengano prontamente rimosse^30,31.

Un tema comune nella proteostasi di membrana è l’uso di proteine AAA+(ATPasi Associate con attività cellulari A)per rimuovere proteine vecchie, danneggiate o mal localizzate dal doppio strato lipidico^{1,32,33,34,35,36,37,38} . Le proteine AAA+ sono motori molecolari che formano anelli esamerici e subiscono movimenti dipendenti dall’ATP per rimodellare un substrato, spesso per traslocazione attraverso uno stretto poro assiale^39,40. Sebbene grande sforzo sia stato dedicato allo studio dell’estrazione di proteine di membrana da parte delle ATPasi AAA+, le ricostituzioni sono complesse o coinvolgono una miscela di lipidi e detergente^41,42,che limita il potere sperimentale di esaminare il meccanismo di estrazione del substrato dal doppio strato lipidico.

Msp1 è un’ATPasi AAA+ altamente conservata ancorata nell’OMM e nei perossisomi che svolge un ruolo critico nella proteostasi di membrana rimuovendo le proteine TA^{43, 44,45,46,47,}erroneamente non localizzate. Msp1 ha anche recentemente dimostrato di alleviare lo stress da importazione di proteine mitocondriali rimuovendo le proteine di membrana che si bloccano durante la traslocazione attraverso l’OMM^48. La perdita di Msp1 o dell’omologo umano ATAD1 provoca frammentazione mitocondriale, fallimenti nella fosforilazione ossidativa, convulsioni, aumento delle lesioni a seguito di ictus e morte precoce^{31,49,50,51,52,53,54,55,56.}

Abbiamo dimostrato che è possibile co-ricostituire le proteine TA con Msp1 e rilevare l’estrazione dal doppio strato lipidico⁵⁷. Questo sistema semplificato utilizza proteine completamente purificate ricostituite in liposomi definiti che imitano l’OMM (Figura 1)^58,59. Questo livello di controllo sperimentale può affrontare dettagliate questioni meccanicistiche di estrazione del substrato che sono sperimentalmente intrattabili con ricostituzioni più complesse che coinvolgono altre proteine AAA +. Qui, forniamo protocolli sperimentali che descrivono in dettaglio i nostri metodi per la preparazione dei liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione. La nostra speranza è che questi dettagli sperimentali facilitino ulteriori studi sul processo essenziale ma poco compreso della proteostasi di membrana.