Восстановление экстракции Msp1 с полностью очищенными компонентами

Правильная клеточная функция зависит от процесса, называемого протеостазом, который гарантирует, что функциональные белки находятся в правильной концентрации и клеточном расположении^1. Сбои в протеостазе приводят к нарушению функции органелл и связаны со многими нейродегенеративными заболеваниями^2,3,4. Мембранные белки представляют собой уникальные проблемы для сети протеостаза, поскольку они должны быть нацелены на правильную мембрану, избегая при этом агрегации из гидрофобных трансмембранных доменов (TMD)^5. Следовательно, специализированные механизмы эволюционировали, чтобы защитить гидрофобную ВНЧС от цитозоля и облегчить нацеливание и введение в правильную клеточную мембрану^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.}

Митохондрии являются метаболическим центром клетки и участвуют в многочисленных важных клеточных процессах, таких как: окислительное фосфорилирование, генерация железо-серного кластера и апоптотическая регуляция^16,17. Эти эндосимбиотические органеллы содержат две мембраны, называемые внутренней митохондриальной мембраной (IMM) и внешней митохондриальной мембраной (OMM). Более 99% из 1 500 митохондриальных белков человека кодируются в ядерном геноме и должны быть перемещены через одну или две различные мембраны^18,19. Таким образом, правильная функция митохондрий зависит от надежной сети протеостаза для исправления любых ошибок в нацеливании на белок или транслокации.

Наша лаборатория фокусируется на подмножестве белков митохондриальной мембраны, называемых белками хвостового якоря (TA), которые имеют один трансмембранный домен на самом С-конце^{20,21,22,23,24.} Белки TA участвуют в ряде важных процессов, таких как апоптоз, транспорт пузырьков и транслокация белка^25. Уникальная топология белков ТА требует посттрансляционной вставки, которая происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ER) по направляющему входу хвостового якорного (GET) или эндоплазматического ретикулярного мембранного белкового комплекса (EMC) или в ОММ по плохо охарактеризованному пути^20,26,27,28. Биофизические свойства ВНЧС необходимы и достаточны для направления белков ТА к правильной мембране^29. Распознавание биофизических характеристик, а не определенного мотива последовательности, ограничивает точность путей нацеливания^5. Таким образом, неправильная локализация белков ТА является общим стрессом для сетей протеостаза. Клеточный стресс, такой как ингибирование пути GET, вызывает увеличение неправильной локализации белка к ОММ и митохондриальную дисфункцию, если эти белки не будут быстро удалены^30,31.

Общей темой в мембранном протеостазе является использование белков AAA+(ATPase A,ссоциированная с клеточными активами A)для удаления старых, поврежденных или неправильно локализованных белков из липидного бислоя^{1,32,33,34,35,36,37,38} . Белки AAA+ представляют собой молекулярные двигатели, которые образуют гексамерные кольца и подвергаются АТФ-зависимым движениям для ремоделирования субстрата, часто путем транслокации через узкую осевую пору^39,40. Хотя большие усилия были посвящены изучению экстракции мембранных белков AAA+ ATPases, реконструкции являются сложными или включают смесь липидов и моющего средства^41,42,что ограничивает экспериментальную способность исследовать механизм экстракции субстрата из липидного бислоя.

Msp1 представляет собой высококонсервативную ААА+ АТФазу, закрепленную в ОММ и пероксисомах, которая играет решающую роль в мембранном протеостазе путем удаления неправильно локализованных белков ТА^{43,44,45,46,47.} Недавно было также показано, что Msp1 облегчает стресс импорта митохондриальных белков путем удаления мембранных белков, которые останавливаются во время транслокации через OMM^48. Потеря Msp1 или человеческого гомолога ATAD1 приводит к фрагментации митохондрий, сбоям в окислительном фосфорилировании, судорогам, увеличению травматизма после инсульта и ранней смерти^{31,49,50,51,52,53,54,55,56.}

Мы показали, что можно совместно воссоздать белки ТА с Msp1 и обнаружить экстракцию из липидного бислоя^57. Эта упрощенная система использует полностью очищенные белки, преобразованные в определенные липосомы, которые имитируют OMM(Рисунок 1)^58,59. Этот уровень экспериментального контроля может решить подробные механистические вопросы экстракции субстрата, которые экспериментально трудноразрешимы с более сложными восстановлениями с участием других белков AAA+. Здесь мы предоставляем экспериментальные протоколы, подробно описывающие наши методы получения липосом, восстановления мембранного белка и экстракционного анализа. Мы надеемся, что эти экспериментальные детали облегчат дальнейшее изучение существенного, но плохо изученного процесса мембранного протеостаза.