Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés

La fonction cellulaire appropriée dépend d’un processus appelé protéostasie, qui garantit que les protéines fonctionnelles sont à la concentration et à l’emplacement cellulaire^{corrects 1}. Les défaillances de la protéostase entraînent une altération de la fonction des organites et sont associées à de nombreuses maladies neurodégénératives^2,3,4. Les protéines membranaires présentent des défis uniques pour le réseau de protéostasie car elles doivent être ciblées sur la membrane correcte tout en évitant l’agrégation des domaines transmembranaires hydrophobes (TMD)⁵. Par conséquent, des machines spécialisées ont évolué pour protéger le TMD hydrophobe du cytosol et faciliter le ciblage et l’insertion dans la membrane cellulaire appropriée^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Les mitochondries sont le centre métabolique de la cellule et sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que: la phosphorylation oxydative, la génération d’amas fer-soufre et la régulation apoptotique^16,17. Ces organites endosymbiotiques contiennent deux membranes, appelées membrane mitochondriale interne (IMM) et membrane mitochondriale externe (OMM). Plus de 99% des 1 500 protéines mitochondriales humaines sont codées dans le génome nucléaire et doivent être transloquées sur une ou deux membranes différentes^18,19. La fonction mitochondriale appropriée dépend donc d’un réseau de protéostasie robuste pour corriger toute erreur dans le ciblage ou la translocation des protéines.

Notre laboratoire se concentre sur un sous-ensemble de protéines membranaires mitochondriales appelées protéines ancrées dans la queue (TA), qui ont un seul domaine transmembranaire au terminus C^{20,21,22,23,24}. Les protéines TA sont impliquées dans un certain nombre de processus essentiels, tels que l’apoptose, le transport des vésicules et la translocation des protéines²⁵. La topologie unique des protéines TA nécessite une insertion post-traductionnelle, qui se produit dans le réticulum endoplasmique (ER) par l’entrée guidée des voies DU complexe protéique membranaire (CEM) ancrées dans la queue (GET) ou du réticulum endoplasmique ou dans l’OMM par une voie mal caractérisée^20,26,27,28. Les propriétés biophysiques du TMD sont nécessaires et suffisantes pour guider les protéines TA vers la membrane correcte²⁹. La reconnaissance de caractéristiques biophysiques plutôt que d’un motif de séquence défini limite la fidélité des voies de ciblage⁵. Ainsi, la mauvaise localisation des protéines TA est un stress commun pour les réseaux de protéostasie. Le stress cellulaire, tel que l’inhibition de la voie GET, provoque une augmentation de la mauvaise localisation des protéines à l’OMM et un dysfonctionnement mitochondrial à moins que ces protéines ne soient rapidement éliminées^30,31.

Un thème commun dans la protéostasie membranaire est l’utilisation de protéines AAA+(ATPase Associée avec des ctivités cellulaires A)pour éliminer les protéines anciennes, endommagées ou mal localisées de la bicouche lipidique^1,32^,33,^{34,35,36,37,38} . Les protéines AAA+ sont des moteurs moléculaires qui forment des anneaux hexamériques et subissent des mouvements dépendants de l’ATP pour remodeler un substrat, souvent par translocation à travers un pore axial étroit^39,40. Bien que de grands efforts aient été consacrés à l’étude de l’extraction des protéines membranaires par les AAA+ ATPases, les reconstitutions sont complexes ou impliquent un mélange de lipides et de détergent^41,42, ce qui limite le pouvoir expérimental d’examiner le mécanisme d’extraction du substrat de la bicouche lipidique.

Msp1 est une ATPase AAA+ hautement conservée ancrée dans l’OMM et les peroxysomes qui joue un rôle essentiel dans la protéostasie membranaire en éliminant les protéines TA mal localisées^{43,44,45,46,47}. Il a également été récemment démontré que Msp1 soulageait le stress lié à l’importation de protéines mitochondriales en éliminant les protéines membranaires qui calent lors de la translocation à travers l’OMM^48. La perte de Msp1 ou de l’homologue humain ATAD1 entraîne une fragmentation mitochondriale, des échecs dans la phosphorylation oxydative, des convulsions, une augmentation des blessures après un accident vasculaire cérébral et une mort prématurée³¹,^49,50,51 ,^{52,53,54,55,56}.

Nous avons montré qu’il est possible de co-reconstituer des protéines TA avec Msp1 et de détecter l’extraction de la bicouche lipidique^57. Ce système simplifié utilise des protéines entièrement purifiées reconstituées en liposomes définis qui imitent l’OMM (Figure 1)^58,59. Ce niveau de contrôle expérimental peut répondre à des questions mécanistes détaillées d’extraction de substrat qui sont expérimentalement insolubles avec des reconstitutions plus complexes impliquant d’autres protéines AAA +. Ici, nous fournissons des protocoles expérimentaux détaillant nos méthodes de préparation des liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction. Nous espérons que ces détails expérimentaux faciliteront l’étude plus approfondie du processus essentiel mais mal compris de la protéostasie membranaire.