用完全纯化的组分重构Msp1提取活性

适当的细胞功能取决于称为蛋白质稳态的过程，该过程确保功能蛋白处于正确的浓度和细胞位置¹。蛋白质稳态的失败导致细胞器功能受损，并与许多神经退行性疾病^2，3，4有关。膜蛋白对蛋白质稳态网络提出了独特的挑战，因为它们必须靶向正确的膜，同时避免疏水性跨膜结构域（TMDs）聚集^5。因此，专门的机器已经发展到可以保护疏水性TMD免受细胞质基质的影响，并促进靶向和插入适当的细胞膜^{6，7，8，9，10，11，12，13，14，15。}

线粒体是细胞的代谢中心，参与许多必要的细胞过程，例如：氧化磷酸化，铁硫簇生成和凋亡调节^16，17。这些内共生细胞器包含两个膜，称为内线粒体膜（IMM）和外线粒体膜（OMM）。超过99%的1，500种人类线粒体蛋白编码在核基因组中，需要在一个或两个不同的膜上易位^18，19。因此，正确的线粒体功能取决于强大的蛋白质稳态网络来纠正蛋白质靶向或易位中的任何错误。

我们的实验室专注于称为尾锚（TA）蛋白的线粒体膜蛋白的子集，它们在C端^{20，21，22，23，24}处具有单个跨膜结构域。TA蛋白参与许多基本过程，例如细胞凋亡，囊泡转运和蛋白质易位^25。TA蛋白的独特拓扑需要翻译后插入，其发生在内质网（ER）中，通过尾锚（GET）或内质网膜蛋白复合物（EMC）途径的引导进入或通过表征不良的途径进入OMM 20，26，27，28。TMD的生物物理特性是必要且足以将TA蛋白引导到正确的膜^29。对生物物理特征而不是定义的序列基序的识别限制了靶向途径的保真度^5。因此，TA蛋白的错位是蛋白质稳态网络的常见压力。细胞应激，例如GET途径的抑制，导致OMM和线粒体功能障碍的蛋白质错位增加，除非这些蛋白质被迅速去除^30，31。

膜蛋白平衡的一个共同主题是使用AAA+（ATP酶A与细胞Activities结合）蛋白从脂质双层中去除旧的，受损的或错位的蛋白质^{1，32，33，34，35，36，37，38} .AAA +蛋白是形成六聚环并经历ATP依赖性运动以重塑底物的分子马达，通常通过狭窄的轴向孔^39，40易位。尽管在研究AAA+ATPases提取膜蛋白方面投入了大量精力，但重构是复杂的或涉及脂质和洗涤剂^41，42的混合物，这限制了从脂质双层中提取底物的机制的实验能力。

Msp1是一种高度保守的AAA + ATP酶，锚定在OMM和过氧化物酶体中，通过去除错位的TA蛋白^{43，44，45，46，47}在膜蛋白平衡中起关键作用。最近还显示，Msp1通过去除在OMM⁴⁸易位期间停滞的膜蛋白来缓解线粒体蛋白导入应激。失去Msp1或人类同源物ATAD1导致线粒体碎片化，氧化磷酸化失败，癫痫发作，中风后损伤增加和早期死亡31，49，50，51，52，53，54，55，56。

我们已经证明，有可能与Msp1共同重建TA蛋白并检测从脂质双层⁵⁷中提取。这个简化的系统使用完全纯化的蛋白质重组成定义的脂质体，模仿OMM（图^{1）58，59。}这种水平的实验控制可以解决底物提取的详细机制问题，这些问题在实验上难以解决，涉及其他AAA +蛋白的更复杂的重构。在这里，我们提供了实验方案，详细介绍了我们的脂质体制备，膜蛋白重构和提取测定的方法。我们希望这些实验细节将有助于进一步研究膜蛋白平衡的基本但知之甚少的过程。