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生化学

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

Published: August 10, 2021
doi:
10.3791/62928
,
1Department of Chemistry & Biochemistry,University of Toledo

概要

여기에서 정의 된 프로테오올리포솜의 완전히 정제 된 구성 요소로 Msp1 추출 활동을 재구성하기위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

산화 인산화 및 세포제 조절의 중심지인 미토콘드리아는 인간의 건강에 중요한 역할을 합니다. 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 항상성(proteostasis)을 유지하기 위한 견고한 품질 관리 시스템에 달려 있습니다. 미토콘드리아 프로테오스타증의 감소는 암, 노화, 신경 변성 및 기타 많은 질병과 관련이 있습니다. Msp1은 잘못 지역화된 꼬리 고정 단백질을 제거하여 프로테오스타시스를 유지하는 외부 미토콘드리아 막에 고정된 AAA+ ATPase입니다. 프로테오올리푸좀으로 재구성된 정제 성분을 사용하여, 우리는 Msp1이 지질 이중층에서 모형 꼬리 고정 단백질을 추출하는 데 필요하고 충분하다는 것을 보여주었습니다. 우리의 단순화 된 재구성 시스템은 막 단백질 추출의 상세한 연구를 방해 한 기술적 장벽의 몇 가지 극복. 여기서, 우리는 리포솜, 막 단백질 재구성 및 Msp1 추출 분석의 생성을 위한 상세한 방법을 제공합니다.

Introduction

적절한 세포 기능은 프로테오스타시스라는 공정에 따라 달라지며, 이는 기능성 단백질이 올바른 농도 및 세포 위치1에있는지 확인합니다. 프로테오스타증의 실패는 손상된 세포간 기능으로 이어지며 많은 신경 퇴행성질환2,3,4와연관된다. 멤브레인 단백질은 소수성 막 도메인(TMDs)5로부터응집되는 것을 피하면서 올바른 멤브레인을 대상으로 해야 하기 때문에 프로테오스타증 네트워크에 고유한 과제를 제시한다. 따라서, 특수기계는 사이토솔으로부터 소수성 TMD를 보호하고 적절한 세포막6,7,8,9,10,11,12,13,14,15에대한 표적화 및 삽입을 용이하게 하기 위해 진화하였다.

미토콘드리아는 세포의 대사 허브이며 산화 인산화, 철황 클러스터 생성 및 세포세포조절(16,17)과같은 수많은 필수 세포 과정에 관여한다. 이러한 내시비골 세포기관은 내부 미토콘드리아 막(IMM) 및 외부 미토콘드리아 막(OMM)이라고 하는 두 개의 멤브레인을 함유하고 있다. 1,500개의 인간 미토콘드리아 단백질의 99% 이상이 핵 게놈에 인코딩되며 하나 또는 두 개의 다른 멤브레인18,19를통해 전이되어야 합니다. 따라서 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 표적화 또는 전좌의 오류를 교정하기 위해 강력한 프로테오스타증 네트워크에 의존합니다.

우리 실험실은 매우 C-terminus20,21,22,23,24에서단일 막 도메인을 갖는 꼬리 고정 (TA) 단백질이라고 불리는 미토콘드리아 막 단백질의 하위 집합에 초점을 맞추고 있습니다. TA 단백질은 아포토시스, 소포 수송 및 단백질전좌(25)와같은 여러 필수 공정에 관여한다. TA 단백질의 독특한 토폴로지는20,26,27,28에의해 꼬리 고정(GET) 또는 내피성 망상 막 단백질 복합체(EMC) 경로 또는 OMM로 의 유도 진입에 의해 내피성 망상(ER)에서 발생하는 번역 후삽입이필요합니다. TMD의 생물학적 특성은 TA 단백질을 올바른멤브레인(29)으로유도하기에 충분하고 충분하다. 정의된 서열 모티브가 아닌 생물물리학적 특성의 인식은 표적 통로5의충실도를 제한한다. 따라서, TA 단백질의 오현지화는 프로테오스타증 네트워크에 대한 일반적인 스트레스이다. GET 통로의 억제와 같은 세포 스트레스는 이러한 단백질이 즉시제거되지않는 한 OMM 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 단백질 오현지화의 증가를 일으킨다30,31.

막 프로테오스타증의 일반적인 주제는 AAA+(세포 Activities로 분리된 TPase A)단백질을 사용하여 지질 이중층1, 32,33,34,35,36,37,38에서 오래된, 손상또는 잘못 지역화된 단백질을 제거하는것입니다. . AAA+ 단백질은 hexameric 링을 형성하고 ATP 의존적인 움직임을 거쳐 기판을 리모델링하는 분자 모터이며, 종종 좁은 축 모공을 통해 전좌로39,40을한다. AAA+ ATPases에 의해 막 단백질의 추출을 연구하는 데 큰 노력이 전념되었지만, 재구성은 복잡하거나 지질 양성자로부터 기판 추출 메커니즘을 검사하는 실험력을 제한하는 지질 및 세제41,42의혼합물을 포함합니다.

Msp1은 OMM 및 peroxisomes에 고정된 매우 보존된 AAA+ ATPase로, 잘못 지역화된 TA 단백질43,44,45,46,47을제거하여 막 프로테오스타시스에서 중요한 역할을 한다. Msp1은 또한 최근에 OMM48을가로질러 전가되는 막 단백질을 제거하여 미토콘드리아 단백질 수입 스트레스를 완화하는 것으로 나타났다. Msp1 또는 인간 호모로그 ATAD1의 손실은 미토콘드리아 단편화, 산화 인산화, 발작, 뇌졸중 후 부상 증가, 조기 사망31,49,50,51,52,53,54,55, 56을초래한다.

우리는 Msp1과 TA 단백질을 공동 재구성하고 지질이중층(57)으로부터추출을 검출할 수 있음을 보여주었다. 이러한 단순화된 시스템은 OMM(도1)58,59를모방한 정의된 리포솜으로 재구성된 완전 정제 된단백질을사용합니다. 실험 적인 대조의이 수준은 다른 AAA+ 단백질을 관련시키는 더 복잡한 재구성으로 실험적으로 난치성 기판 추출의 상세한 기계론적 질문을 해결할 수 있습니다. 여기서, 우리는 리포솜 제제, 막 단백질 재구성 및 추출 분석법을 위한 우리의 방법을 상세히 설명하는 실험 프로토콜을 제공합니다. 이러한 실험적 세부 사항이 멤브레인 프로테오스타증의 필수적이지만 제대로 이해되지 않은 과정에 대한 추가 연구를 용이하게 할 수 있기를 바랍니다.

Protocol

1. 리포솜 준비 지질의 클로로폼 스톡을 적절한 비율로 결합하여 외부 미토콘드리아 막을 모방합니다. 지질 혼합물 25 mg을 준비합니다. 미토콘드리아 막을 모방한 지질의 이전에 확립된 혼합물을 사용하고, 48:28:10:10:4 닭고기 계란 인산단 콜린 콜린 (PC), 치킨 계란 인파디딜 에탄올라민 (PE), 소 간 인파디올 이노 시 톨 (PI), 합성 1,2-디오의 어금니 비율 [sn-glycero-3-phospho-L-serine] 및 합성 1′,…

Representative Results

결과를 제대로 해석하려면 얼룩이없는 젤과 서부 얼룩을 함께 보아야합니다. 얼룩없는 젤은 모든 샘플에 걸쳐 동일한 로딩을 보장합니다. 얼룩 없는 젤을 볼 때, 샤페론(GST-칼모둘린 및 GST-SGTA)은 입력(I) 및 ELUTE(E) 레인에서 볼 수 있습니다. 이러한 대역의 강도가 모든 입력 샘플에서 균일한지 다시 확인합니다. 마찬가지로 ELUTE 샘플에서 강도가 균일하게 유지되도록 합니다. ELUTE는 입력보다 5배 더 …

Discussion

적절한 미토콘드리아 기능은 강력한 단백질 품질 관리 시스템에 따라 달라집니다. TA 단백질 표적화 경로의 충실도에 내재된 한계로 인해 잘못 지역화된 TA 단백질은 미토콘드리아에 대한 지속적인 스트레스 원천입니다. 미토콘드리아 프로테오스테아증 네트워크의 핵심 성분은 OMM에서 잘못 국산화된 TA 단백질을 제거하는 멤브레인 고정 AAA+ ATPase인 Msp1입니다. 여기에서, 우리는 proteoliposomes를 준비…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLW는 시카고 대학의 로버트 키넌 박사와 함께 박사 후 연구 를 하는 동안이 프로토콜의 일부를 개발했습니다.

이 작업은 MLW에 NIH 보조금 1R35GM137904-01에 의해 투자된다.

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017
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Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).
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