概要

Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés

Published: August 10, 2021
doi:

概要

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la reconstitution de l’activité d’extraction msp1 avec des composants entièrement purifiés dans des protéoliposomes définis.

Abstract

En tant que centre de phosphorylation oxydative et de régulation apoptotique, les mitochondries jouent un rôle vital dans la santé humaine. La fonction mitochondriale appropriée dépend d’un système de contrôle de la qualité robuste pour maintenir l’homéostasie des protéines (protéostasie). Le déclin de la protéostase mitochondriale a été lié au cancer, au vieillissement, à la neurodégénérescence et à de nombreuses autres maladies. Msp1 est une ATPase AAA+ ancrée dans la membrane mitochondriale externe qui maintient la protéostasie en éliminant les protéines mal localisées ancrées dans la queue. En utilisant des composants purifiés reconstitués en protéoliposomes, nous avons montré que Msp1 est nécessaire et suffisant pour extraire une protéine modèle ancrée dans la queue d’une bicouche lipidique. Notre système reconstitué simplifié surmonte plusieurs des barrières techniques qui ont entravé l’étude détaillée de l’extraction des protéines membranaires. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour la génération de liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction Msp1.

Introduction

La fonction cellulaire appropriée dépend d’un processus appelé protéostasie, qui garantit que les protéines fonctionnelles sont à la concentration et à l’emplacement cellulairecorrects 1. Les défaillances de la protéostase entraînent une altération de la fonction des organites et sont associées à de nombreuses maladies neurodégénératives2,3,4. Les protéines membranaires présentent des défis uniques pour le réseau de protéostasie car elles doivent être ciblées sur la membrane correcte tout en évitant l’agrégation des domaines transmembranaires hydrophobes (TMD)5. Par conséquent, des machines spécialisées ont évolué pour protéger le TMD hydrophobe du cytosol et faciliter le ciblage et l’insertion dans la membrane cellulaire appropriée6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Les mitochondries sont le centre métabolique de la cellule et sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que: la phosphorylation oxydative, la génération d’amas fer-soufre et la régulation apoptotique16,17. Ces organites endosymbiotiques contiennent deux membranes, appelées membrane mitochondriale interne (IMM) et membrane mitochondriale externe (OMM). Plus de 99% des 1 500 protéines mitochondriales humaines sont codées dans le génome nucléaire et doivent être transloquées sur une ou deux membranes différentes18,19. La fonction mitochondriale appropriée dépend donc d’un réseau de protéostasie robuste pour corriger toute erreur dans le ciblage ou la translocation des protéines.

Notre laboratoire se concentre sur un sous-ensemble de protéines membranaires mitochondriales appelées protéines ancrées dans la queue (TA), qui ont un seul domaine transmembranaire au terminus C20,21,22,23,24. Les protéines TA sont impliquées dans un certain nombre de processus essentiels, tels que l’apoptose, le transport des vésicules et la translocation des protéines25. La topologie unique des protéines TA nécessite une insertion post-traductionnelle, qui se produit dans le réticulum endoplasmique (ER) par l’entrée guidée des voies DU complexe protéique membranaire (CEM) ancrées dans la queue (GET) ou du réticulum endoplasmique ou dans l’OMM par une voie mal caractérisée20,26,27,28. Les propriétés biophysiques du TMD sont nécessaires et suffisantes pour guider les protéines TA vers la membrane correcte29. La reconnaissance de caractéristiques biophysiques plutôt que d’un motif de séquence défini limite la fidélité des voies de ciblage5. Ainsi, la mauvaise localisation des protéines TA est un stress commun pour les réseaux de protéostasie. Le stress cellulaire, tel que l’inhibition de la voie GET, provoque une augmentation de la mauvaise localisation des protéines à l’OMM et un dysfonctionnement mitochondrial à moins que ces protéines ne soient rapidement éliminées30,31.

Un thème commun dans la protéostasie membranaire est l’utilisation de protéines AAA+(ATPase Associée avec des ctivités cellulaires A)pour éliminer les protéines anciennes, endommagées ou mal localisées de la bicouche lipidique1,32,33,34,35,36,37,38 . Les protéines AAA+ sont des moteurs moléculaires qui forment des anneaux hexamériques et subissent des mouvements dépendants de l’ATP pour remodeler un substrat, souvent par translocation à travers un pore axial étroit39,40. Bien que de grands efforts aient été consacrés à l’étude de l’extraction des protéines membranaires par les AAA+ ATPases, les reconstitutions sont complexes ou impliquent un mélange de lipides et de détergent41,42, ce qui limite le pouvoir expérimental d’examiner le mécanisme d’extraction du substrat de la bicouche lipidique.

Msp1 est une ATPase AAA+ hautement conservée ancrée dans l’OMM et les peroxysomes qui joue un rôle essentiel dans la protéostasie membranaire en éliminant les protéines TA mal localisées43,44,45,46,47. Il a également été récemment démontré que Msp1 soulageait le stress lié à l’importation de protéines mitochondriales en éliminant les protéines membranaires qui calent lors de la translocation à travers l’OMM48. La perte de Msp1 ou de l’homologue humain ATAD1 entraîne une fragmentation mitochondriale, des échecs dans la phosphorylation oxydative, des convulsions, une augmentation des blessures après un accident vasculaire cérébral et une mort prématurée31,49,50,51 ,52,53,54,55,56.

Nous avons montré qu’il est possible de co-reconstituer des protéines TA avec Msp1 et de détecter l’extraction de la bicouche lipidique57. Ce système simplifié utilise des protéines entièrement purifiées reconstituées en liposomes définis qui imitent l’OMM (Figure 1)58,59. Ce niveau de contrôle expérimental peut répondre à des questions mécanistes détaillées d’extraction de substrat qui sont expérimentalement insolubles avec des reconstitutions plus complexes impliquant d’autres protéines AAA +. Ici, nous fournissons des protocoles expérimentaux détaillant nos méthodes de préparation des liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction. Nous espérons que ces détails expérimentaux faciliteront l’étude plus approfondie du processus essentiel mais mal compris de la protéostasie membranaire.

Protocol

1. Préparation des liposomes Combinez les stocks de chloroforme de lipides dans des proportions appropriées pour imiter la membrane mitochondriale externe. Préparer 25 mg de mélange lipidique. Nous utilisons un mélange précédemment établi de lipides qui imitent les membranes mitochondriales, constitué d’un rapport molaire de 48:28:10:10:4 de phosphatidylcholine (PC), de phosphatidyléthanolamine (PE) d’œuf de poule, de phosphatidyl inositol (PI) du foie bovin, de 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3…

Representative Results

Pour interpréter correctement les résultats, le gel sans tache et le western blot doivent être vus ensemble. Le gel sans tache assure une charge égale sur tous les échantillons. Lors de la visualisation du gel sans taches, les accompagnateurs (GST-calmoduline et GST-SGTA) seront visibles dans les voies INPUT (I) et ELUTE (E). Vérifiez que l’intensité de ces bandes est uniforme dans tous les échantillons INPUT. De même, assurez-vous que l’intensité est uniforme dans les échantillons ELUTE. L’ELUTE est 5x …

Discussion

Le bon fonctionnement mitochondrial dépend d’un système robuste de contrôle de la qualité des protéines. En raison des limites inhérentes à la fidélité des voies de ciblage de la protéine TA, les protéines TA mal localisées sont une source constante de stress pour les mitochondries. Un composant clé du réseau de protéostasie mitochondriale est Msp1, qui est une ATPase AAA+ ancrée dans la membrane qui élimine les protéines TA mal localisées de l’OMM. Ici, nous avons décrit comment préparer des pro…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLW a développé une partie de ce protocole pendant ses études postdoctorales avec le Dr Robert Keenan à l’Université de Chicago.

Ce travail est financé par la subvention NIH 1R35GM137904-01 à MLW.

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017

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記事を引用
Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).

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