פרוטוקול מוצג שילוב של ניקוי רקמות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM) כדי לקבל תמונות רזולוציה תלת מימדית ותאי של כלי הלימפה ובלוטות הלימפה (LNs) איסוף נוזל המוח השדרה (CSF) ונוזל אפידורל השדרה.
מערכת הלימפה הקשורה למערכת העצבים המרכזית (CNS) כוללת את כלי הדם הלימפה המסתובב סביב המוח, חוט השדרה, ו- LNs המשויך שלה. מערכת הלימפה הקשורים CNS מעורב ניקוז של CSF מקרומולקולות ותאי מערכת החיסון meningeal כלפי CNS ניקוז LNs, ובכך ויסות פינוי פסולת ומעקב חיסוני בתוך רקמות CNS. מוצגת גישה חדשנית כדי לקבל תמונות תלת מימדיות (3D) ורזולוציה תאית של לימפה הקשורים CNS תוך שמירה על שלמות המעגלים שלהם בתוך הרקמות שמסביב. iDISCO+ פרוטוקול משמש immunolabel כלי לימפה במערך ופינה כל ההכנות הר של עמודה החוליות כי הם לאחר מכן תמונה עם מיקרוסקופית פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM). הטכניקה חושפת את המבנה תלת-מיואש של רשת הלימפה המחברת את חללי קרום המוח והאפידורל סביב חוט השדרה לכלי לימפה מחוץ לחלית חוליות. מסופקים תמונות תלת-מיוד של מעגלי הניקוז של מעקבים מולקולריים שהוזרקו בעבר לתוך CSF דרך מגנה בור המים או parenchyma עמוד השדרה thoracolumbar. הגישה iDISCO+/ LSFM מביא הזדמנויות חסרות תקדים לחקור את המבנה והתפקוד של מערכת הלימפה הקשורים CNS בביולוגיה נוירווסקולרית, נוירואימונולוגיה, סרטן המוח וחלייתנים, או עצם החוליות וביולוגיה משותפת.
CNS מוקף CSF שכבות כיסוי של קרום המוח, רקמת אפידורל, ועצמות. בסך הכל, CSF מספק הגנה פיזית למוח הרך וחוט השדרה. הוא הופרש בעיקר על ידי הממחורוד וקרום קרום קרום מדומה (כלומר, פיא מאטר, הארכנואיד, וdura mater). קומפלקס CSF-meningeal גם מבסס ממשק פונקציונלי בין רקמות CNS ושאר הגוף, ובכך תורם להומוסטאזיס CNS. ראשית, CSF חודר parenchyma CNS דרך חללים פרה עורקים CNS ומקיים אינטראקציהדינמית עם נוזל interstitial (ISF) 1 באמצעות מערכת גלימפטית (גליה לימפה), אשר מורכב חללים paravascular ואת ממברנות הרגליים הקצה אסטרוציט סביב כלי CNS2,,3,,4. פסולת מטבולית ונוזל עודף מנוקים בסופו של דבר על ידי ניקוז פריוואסקולרי תוך-מזוראלי ישירות מהפארנצ’ימה במוח לכיווןמחזור הדם המערכתי 3, כמו גם את החללים הפרארידיים לכיוון CSF ובדרך כלי לימפה מרוקן מוח, על פי מודל גלימפטי2,4. זרימת CSF היא בעיקר דרך מערכת הלימפה, דרך לוח cribriform וכלי לימפה חוץ-גולגולתייםקשורים 5,6,7 , כמוגםעל ידי כלי הלימפה קרום המוח, אשר להתכנס ב LNs ניקוז המוח 8 ,9,10,,1011,12 ( איור1). חשוב, אם כי משני, תפקיד בזרם CSF נלקח על ידי villi ארכנואיד גולגולתי, אשר לחדור lacuna של סינוסים ורידי קרוםמנום 13.
מעגלי ניקוז CFS נחקרו בהרחבה באמצעות גישות ניסיוניות המבוססות על הזרקת מעקבים צבעוניים/פלורסנט לתוך CNS או CSF, ואחריו ההדמיה של דפוס המעקב בתוך CNS וברחבי איברי הגוף ורקמות בנקודות זמן שונות לאחרהזרקה 13. במשך זמן רב, הזרימה של CSF נחשב באופן בלעדי וישיר נלקח בתשלום על ידי זרימת הדם, דרך villi ארכנואיד הקרנה לתוך סינוסים ורידי דוראל13. עם זאת, הזרימה CSF מבוצעת בעיקר על ידי כלי הדם הלימפה, כפי שהוצג לאחרונה על ידי כמעט אינפרא אדום (NIR) הדמיה דינמית של CSF מוזרק מעקב תחבורה בעכברים9,10. כלי הלימפה מנקזים CSF ואז להחזיר את הלימפה למחזור הדם דרך וווין subclavian הנכון. approches משלימים זיהוהן מחוץcranial 6, 7,,13 ו תוך גולגולתי 9,10,11,12 יציאות לימפה של מעקבים מוזרקים CSF ולהציע כי CSF נספג על ידי שני מסלולים לימפה, אחד חיצוני והשני פנימי לגולגולת ועמוד חוליות.7 החלק העיקרי של ניקוז CSF מתרחש במהירות דרך כלי לימפה הממוקמים rostrally, מחוץ לגולגולת רירית האף, דרך ערוצים של צלחת cribriform של עצם אתמואיד3,6,13, ו, caudally, מחוץ עצמות חוליות lumbosacral דרך נתיבים דורסולטיים שעדיין לא מאופייניםבאופן מלא 7,14. בנוסף, קרום המוח של הגולגולת, נימים לימפה של דורה מאטר ישיר לספוג CSF ותאי מנינג איל חיסוני כלפי אספנים לימפה דוראלית לחצות את עצמות הגולגולת ולהתחבר CNS ניקוז LNs12,14. כלי לימפה קרום המוח אלה לשחק תפקידים חשובים פתופיזיולוגיה CNS, כי המוח קרום המוח לימפה משתנים עם הזדקנות וגם להשפיע על התוצאה של מחלות מוח נוירולוגיות, כולל ניוון עצבי, דלקת עצבית, סרטן המוח15,16,17. לכן, כלי הדם הלימפה הקשורים CNS (כלומר, כלי הלימפה דוראליים והיקפיים מנקז CSF) עשוי להיות יעד חדשני מבטיח להילחם במחלות CNS בבני אדם.
מחקרים מתכנסים שבוצעו עם אימונוהיסטולוגיה והדמיית תהודה מגנטית ברזולוציה גבוהה הראו כי כלי הדם הלימפה קרום קרום לב קיים גם פרימטים, כולל קופי מרמוסטנפוצים ובני אדם 7,11,13. יתר על כן, כלי לימפה מנינגאליים אינם מוגבלים לגולגולת, אבל להרחיב בתוך עמוד החוליות אל פני השטח של גנגליה עמוד השדרה ו רמי13,18. הדמיה תלת מימדית (תלת מימדית) של עמוד החוליות הלימפה משמרת את האנטומיה הכוללת של דגימות חוליות ועמוד שדרה מסומנות, כולל עצמות מעל, שרירים, רצועות, כמו גם רקמות קרביים שכנות, בוצע לאחרונה14. iDISCO+ פרוטוקול 19,20 שימש immunolabel decalcified ופינה את ההכנות של כל עמוד החוליות עם נוגדנים ספציפיים לימפה נגד קולטן ממברנה LYVE121 או גורם שעתוק PROX122. רכישת תמונה וניתוח בוצעו לאחר מכן עם מיקרוסקופית פלואורסכיה גיליון אור (LSFM) ותווך Imaris. LSFM מאפשר הדמיה תלת-ממדית מהירה ופולשנית מינימלית של דגימות גדולות על ידי כליאה סיסית של תאורה, מה שתוצאתו פוטו-בליחות מופחתתופוטוטו-אקסציטיות 23.
הגישה iDISCO+/ LSFM מאפשרת אפיון של השכבות הברורות של כלי לימפה דוראליים ואפידורליים, ואת החיבור של כלי דם זה למעגלים הלימפה מחוץ לחת החוליות וLNs השכן עמודה החוליות. הפרוטוקול הוחל על רקמות שהוזרקו בעבר עם מעקבי פלורסנט כדי להדגים ניקוז תעלת חוליות. המאמר הנוכחי מספק פרטים על iDISCO+/LSFM מתודולוגיית כדי למצוא את כלי הדם הלימפה החוליות וממחיש את הרלוונטיות שלה CSF וחדריקת ניקוז נוזל אפידורל.
פרוטוקול iDISCO+/LSFM מספק תצוגות תלת-מידות חסרות תקדים של רשת הלימפה הקשורה ל-CNS בתוך הרקמות שמסביבה ברמת רזולוציה תאית. פרוטוקול זה מותאם היטב לדגימות בגודל בינוני, ולא מדגים 1.5ס”מ 3, בשל המגבלות של המערכת האופטית LSFM, מרחק העבודה המופחת, ואת הגודל הגדול של עדשות אובייקטיביות מסחריות עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה23. מגבלה זו מונעת לכידת כל מערכת הלימפה הקשורה למוח. חשוב לציין כי תחום החקירה צריך להיות מופרד בזהירות ואת הרקמות הסובבות את מערכת העצבים תק יש לנתח בזהירות על מנת לכלול את כלי הלימפה החוץ-גולגולתיים ו-LNs שתורמים לכל המעגלים הלימפטיים(טבלה 2).
בנוסף לשיקולים גודל ואנטומיים, המורכבות של רקמות mesenchymal שמסביב משתנה לאורך הגולגולת ועמוד החוליות, אשר דורש התאמה של מדבקות וטיפול preclearing על מנת לקבל הבהרה מדגם הומוגני ולאפשר הפצת קרן אור בתוך רקמה ביולוגית איזוטרופית רכה. בהיעדר עצמות, הדמיית LFSM של המוח או רקמות חוט השדרה אינה מחייבת את שלב הממתג, ואת הרזולוציה הסופית של התמונות שנתפסו הואאופטימלי 19. הפרוטוקול המתואר לעיל, הכולל שלב מדבקות מתון עם הפתרון של מורס, מותאם היטב להדמיית LSFM של עמודת החוליות כפי שמוצג באות 1 ואיור 4. לעומת זאת, אזור הצוואר מציג אנטומיה מורכבת במיוחד של עצם בנוסף לשכבות מרובות של שרירים, שומן, ורקמות הבלוטות, אשר להפחית את האיכות של תמונות LSFM שנתפסו, כפי שמשתקף איור 3B. הדמיית LSFM של אזור הצוואר וצוואר הרחם עשויה להיות משופרת על ידי טיפול מחמיר יותר של רקמות; לדוגמה, עם EDTA, כפי שדווח בעבר24. השלב מדבקה ולכן הוא קריטי ותנאי מדבקות יש לבדוק בעבר עבור כל נוגדן בשימוש לפני הפעלת iDISCOהמלא + פרוטוקול (טבלה 2).
בעוד פרוטוקול iDISCO+/LSFM מאפשר יצירת תצוגה תלת-מית-מיו של חיבור מעגלים בין מנום המוח ומרחבי אפידורל ו- LNs המשויך, הניתוח הכמותי הישיר של כלי הדם הלימפה מתמונות LSFM שנתפסו אינו אפשרי מהסיבות הבאות: 1) התיוג של מעגלי כלי לימפה אינו אמין בשל דפוס בלתי רציף של ביטוי סמן לימפה, כי membranar LYVE1 מופץבזאת 21 ו PROX1 יש דפוס ביטויגרעיני 22; 2) החדירה הטרוגנית של נוגדנים, כמו גם אניסוטרופיה שעשויה להימשך ברקמה הביולוגית בשל מדבקות הטרוגניות לא שלמות והטרוגנית וpreclearing. הדמיית LSFM צריכה להיות מורחבת על ידי כלי מציאות מדומה המאפשרים הדמיה אינטראקטיבית ובכך להקל על כימות של כלי הדם הלימפה (www.syglass.io). כמו כן, ראוי לציין כי התיאור המדויק של המעגלים הקשורים CNS דורש גיבוי מידע LSFM עם נתונים ברזולוציה גבוהה confocal שהושגו על ידי immunolabeling קונבנציונלי על דק (5–10 μm) cryostat או פרפין מוטבע רקמות מקטעים, במיוחד כדי למקם במדויק את המיקום של כלי לימפה לגבי dura mater ו CSF, כפי שדווח בעבר11,14,18.
פרוטוקול iDISCO+/LSFM מאפשר הדמיה תלת מימדית של הניקוז המקרומולקולרי במערכת הלימפה המשויכת ל-CNS, כפי שמוצג באיור 3 ואיור 4. עם זאת, ההערכה הפונקציונלית של ניקוז הלימפה דורשת, בנוסף להמלצות על iDISCO+/ LSFM פרוטוקול מפורט לעיל, לאחר הליך קפדני, כמו התוצאה הסופית תלויה באיכות של ניתוח ההזרקה, הבחירה של אתר המסירה, סוג ונפח מוזרק של סמן macromolecule בשימוש, ואת זמן ההקרבה לאחר ניהול מעקב (טבלה 2). בשל וריאציות של דפוס המעקב בין בעלי חיים מוזרקים, האפיון של מעגלי ניקוז לימפה דורש קבוצות ניסיוניות גדולות (>10 על ידי מצב הזרקה). בפרוטוקול שהוצג, 1) מאטר dura חייב להיות מנוקב לפני הזרקה כדי למנוע נגעים לא רצויים וחדירה לתוך רקמות CNS; 2) הנפח המוזרק צריך להיות פחות מ 2 μL כדי להגביל דיפוזיה לא רצויה דרך חור ההזרקה, לאורך נימי ההזרקה, לתוך שטח אפידורל או רקמות מחוץ לחלית לבן; 3) את מעמקות הכניסה הנמת הזרקה יש מוגבל 2 מ”מ מתחת מאטר דורה כדי למנוע פגיעה CNS או תסיסה בזריקות ICM ותוך שדרתי, בהתאמה. שימו לב גם כי ניתוח confocal ברזולוציה גבוהה משלימה של מקטעים חוליות שכנים צריך להתבצע, כאמור לעיל, כדי להעריך את הנוכחות של מעקב מוזרק בתוך כלי הלימפה. ניתוח זה דורש ביסוס חלקות פרופיל העוצמה עבור המעקב ואת סמן הלימפה על חתךים צולבים של כלי לימפה עם תווית מרקר. גישה זו שימשה בעבר כדי להפגיןספיגת OVA 555 על ידי לימפה ThLb ב 15 דקות לאחר ההזרקה (דמות משלימה 5F ביעקב ואח’14). עם זאת, זה לא היה מאויר עבור מעקב אנטי LYVE1 במחקר הנוכחי(איור 4).
בין מעקבי CSF אפשריים, OVA-A555 היא אפשרות מצוינת כפי שהוא עמיד iDISCO+ טיפולים פרוטוקול ושומר על פלואורסץ גבוה עבור הדמיית LSFM. עם זאת, שים לב שיש לבחור את סוג המעקב בהתאם לנקודת הזמן לניתוח (טבלה 1 וטבלה 2). כפי שדווח לעיל, OVA-A555 תיוג של כלי לימפה חולייתן מקומיים נצפתה ב 15 דקות לאחרהזרקה 14. עם זאת, OVA-A555 אינו מזוהה עוד במעגלים לימפה מקומיים אלה ב 45 דקות לאחרההזרקה (איור 3)בניגוד נוגדן LYVE1(איור 4).
לסיכום, iDISCO+/ LSFM פרוטוקול מותאם היטב לחקירת מבנה 3D וניקוז של מערכת הלימפה הקשורים CNS בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון CNS וסרטן עמודה חולייתן, או עצם חוליות ומחלות מפרקים. למרות שההליך המלא ארוך ודורש קשיחות מתודולוגית, הוא מספק מידע ייחודי בעל ערך בעת שימוש בניתוח משלים באמצעות כלי מציאות מדומה והדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סאנטה et de la Recherche רפואי, Agence הלאומי Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), הפדרציה לשפוך la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), קרנוט התבגרות (אל.ג’יי), אוניברסיטת הפדרלי דה ריו דה ז’ניירו (UFRJ עבור J.B.), NIH (R01EB016629-01) ואת בית הספר לרפואה של ייל. אנו מכירים בפלטפורמות ICM: ICM-QUANT להדמיה תאית והיסטומיקה ICM עבור אימונוהיסטוכימיה. כל העבודה בבעלי חיים נערכה במתקן PHENO-ICMice. הליבה נתמכת על ידי 2 “Investissements d’avenir” (ANR-10- IAIHU-06 ו ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) ו”Fondation pour la Recherche Médicale”. אנו מכירים את ניקולס רנייה על ייעוץ מתודולוגי וקריאת כתבי יד.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |