يتم تقديم بروتوكول يجمع بين إزالة الأنسجة مع المجهر الفلوري ورقة الضوء (LSFM) للحصول على صور ثلاثية الأبعاد والخلوية دقة الأوعية اللمفاوية والعقد الليمفاوية (LNs) جمع السائل النخاعي (CSF) والسوائل فوق الجافية الشوكي.
الجهاز اللمفاوي المرتبط بالجهاز العصبي المركزي (CNS) يشمل الأوعية اللمفاوية التي تدور حول الدماغ والحبل الشوكي واللسنان المرتبطة بها. ويشارك الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS في تصريف الجزيئات الضامة CSF والخلايا المناعية السحائية نحو النفثالينات التي تستنزف الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي تنظيم إزالة النفايات والمراقبة المناعية داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي. يقدم هو نهج جديد للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) وصور القرار الخلوية من اللمفاويات المرتبطة CNS مع الحفاظ على سلامة دوائرها داخل الأنسجة المحيطة بها. يستخدم بروتوكول iDISCO+ لأوعية اللمفاوية في مستحضرات الزاميكبل ومصونة كاملة من العمود الفقري التي يتم تصويرها في وقت لاحق مع المجهر الفلورية ورقة الضوء (LSFM). وتكشف هذه التقنية عن البنية ثلاثية الأبعاد للشبكة اللمفاوية التي تربط المساحات السحاية وفوق الجافية حول الحبل الشوكي بالأوعية اللمفاوية خارج الفقر. وتقدم صور 3D من دوائر الصرف من المقتفيات الجزيئية حقن سابقا في إما CSF عبر ماغنا cisterna أو البارنشيما الشوكي الصدري. يقدم نهج iDISCO+/ LSFM فرصًا غير مسبوقة لاستكشاف بنية ووظيفة الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS في علم الأحياء العصبية الوعائية ، وعلم المناعة العصبية ، وسرطان الدماغ والفقاري ، أو العظام الفقارية وبيولوجيا المفاصل.
ويحيط الجهاز العصبي المركزي من قبل CSF وطبقات من الطبقات من السحايات، والأنسجة فوق الجافية، والعظام. وإجمالا، يوفر CSF الحماية المادية للدماغ الناعم والحبل الشوكي. ويفرز أساسا من قبل plexus المشيمية والأغشية السحائية (أي، ماطر بيا، arachnoid، وماطر دورا). كما ينشئ مجمع CSF-meningeal واجهة وظيفية بين أنسجة الجهاز العصبي المركزي وبقية الجسم، مما يساهم في تحلل الجهاز العصبي المركزي. أولاً، تخترق CSF الجهاز العصبي المركزي من خلال المساحات شبه الشريانية للجهاز العصبي المركزي وتتفاعل ديناميكيًا مع السائل الخلالي (ISF)1 عبر نظام الزلمية (glia-lymphatic) الذي يتكون من المساحات شبه الوعائية وأغشية نهاية القدمين الفلكية حول أوعية الجهاز العصبي المركزي2،3،4. ثم يتم مسح النفايات الأيضية والسوائل الزائدة في نهاية المطاف عن طريق الصرف الصحي داخل الجسمية الداخلية مباشرة من الدماغ parenchyma نحو الدورة الدموية الجهازية3، وكذلك المساحات البارافينيوس نحو CSF وعبر اوعية اللمفاوية المستنزفة للدماغ ، وفقا لنموذج غليففياتيك2،4. تدفق السائل السائل السائل هو أساسا عن طريق النظام اللمفاوي، من خلال صفيحة cribriform والأوعية اللمفاوية خارج الوكرالية المرتبطة5،6،7، وكذلك من قبل الأوعية اللمفاوية السحاية ، والتي تتلاقى في LNs هجرة الأدمغة8،9،10،11،12 ( الشكل1). مهم, على الرغم الثانوية, يتم اتخاذ دور في تدفق CSF من قبل الزغب العنكبوتي القحفي, التي تخترق الثغرات في الجيوب الأنفية الوريدية13.
وقد تم التحقيق على نطاق واسع الدوائر الصرف CFS من خلال النهج التجريبية على أساس حقن الملون / الفلورسنت التتبع في الجهاز العصبي المركزي أو CSF، تليها تصوير نمط التتبع داخل الجهاز العصبي المركزي وفي جميع أنحاء أعضاء الجسم والأنسجة في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن13. لفترة طويلة، واعتبر تدفق CSF أن تكون حصرا ومباشرة في تهمة الدورة الدموية، من خلال الزغب arachnoid إسقاط في الجيوب الأنفية الوريدية13. ومع ذلك، يتم إجراء تدفق CSF في الغالب من قبل الأوعية الدموية اللمفاوية، كما هو موضح مؤخرا من قبل الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) التصوير الديناميكي من نقل التتبع CSF حقن في الفئران9،10. ثم تعود الأوعية اللمفاوية التي تستنزف الغدد الليمفاوية CSF إلى مجرى الدم عبر الوريد تحت التفكاني الأيمن. وقد اكتشفت approches التكميلية كلا من خارج الجمجمة6,,7,,13 و9,,10,,11,12 مخارج اللمفاوية من المقتفيات حقن CSF وتشير إلى أن يتم امتصاص CSF من قبل اثنين من المسارات اللمفاوية, واحد خارجي والآخر الداخلية إلى الجمجمة وعمود العمود الفقري. الجزء الرئيسي من التصريف CSF يحدث بسرعة من خلال الأوعية اللمفاوية الموجودة على شكل مري، خارج الجمجمة في الغشاء المخاطي للأنف، من خلال قنوات لوحة cribriform من عظم ethmoid3،6،13 و ، caudally ، خارج عظام العمود الفقري lumbosacral عبر الطرق دورزولاترال التي لم تتميز بعد بشكل كامل7،14. وبالإضافة إلى ذلك، في شيائن الجمجمة، الشعيرات الدموية من دورا ماطر مباشرة امتصاص CSF والخلايا المناعية السحاية نحو جامعي اللمفاوية dural التي تعبر عظام الجمجمة والاتصال إلى CNS استنزاف LNs12،14. هذه الأوعية اللمفاوية السحابية تلعب أدوارا هامة في علم الفيزيولوجيا المرضية CNS، لأن يتم تغيير اللمفيات السحايا الدماغ عند الشيخوخة وتؤثر أيضا على نتيجة أمراض الدماغ العصبية، بما في ذلك التنكس العصبي، العصبية، وسرطان الدماغ15،16،17. ولذلك، فإن الأوعية الدموية اللمفاوية المرتبطة بـ CNS (أي الأوعية اللمفاوية اللانفائية الطرفية التي تستنزف الـ CSF) قد تكون هدفًا جديدًا واعدًا لمكافحة أمراض الجهاز العصبي المركزي في البشر.
أظهرت الدراسات المتقاربة التي أجريت مع علم المناعة والتصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة أن الأوعية الدموية اللمفاوية السحائية موجودة أيضًا في الرئيسيات ، بما في ذلك marmoset المشتركة والبشر7،11،13. وعلاوة على ذلك، لا تقتصر الأوعية اللمفاوية السحاية على الجمجمة، بل تمتد داخل العمود الفقري إلى سطح العقدة الشوكية ورامي13،18. ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير من اللمفيات العمود الفقري الحفاظ على التشريح العام للعينات الفقرية والعمود الفقري المسمى، بما في ذلك العظام الإفراط والعضلات والأربطة، فضلا عن الأنسجة الحشوية المجاورة، أجريت مؤخرا14. و iDISCO+ بروتوكول19،20 تم استخدامها لdealalbel decalcified وتطهير الاستعدادات من العمود الفقري كله مع الأجسام المضادة الليمفاوية محددة ضد مستقبلات الغشاء LYVE121 أو عامل النسخ PROX122. ثم تم الحصول على الصور وتحليلها باستخدام المجهر الفلوري الخفيف (LSFM) وبرنامج Imaris. LSFM يسمح للتصوير 3D سريعة و الحد الأدنى من الأساليب الجراحية للعينات الكبيرة عن طريق الحبس المحوري للإضاءة، مما يؤدي إلى انخفاض الإضاءة الضوئية وxicity23.
يسمح نهج iDISCO+/ LSFM بتوصيف الطبقات المتميزة من الأوعية اللمفاوية الدوارة وفوق الجافية ، واتصال هذا الأوعية الدموية بالدوائر اللمفاوية اللافقرية وLNs المجاورة للعمود الفقري. وقد طبق البروتوكول على الأنسجة التي تم حقنها سابقاً بتتبعات الفلورسنت لإثبات تصريف القناة الفقرية. تقدم هذه الورقة تفاصيل عن منهجية iDISCO+/ LSFM لتصوير الأوعية الدموية اللمفاوية الفقارية وتوضح مدى أهميتها لـ CSF وتحري تصريف السوائل فوق الجافية.
يوفر بروتوكول iDISCO+/LSFM وجهات نظر ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة للشبكة اللمفاوية المرتبطة بـ CNS داخل الأنسجة المحيطة بها على مستوى الدقة الخلوية. هذا البروتوكول هو تتكيف بشكل جيد مع عينات متوسطة الحجم ، وليس exeeding 1.5 سم3، نظرا للقيود على النظام البصري LSFM ، وانخفاض مسافة العمل ، وحجم كبير من العدسات الهدف التجاري لمجهر عالية الدقة23. يمنع هذا القيد التقاط الجهاز اللمفاوي المرتبط بالمخ بأكمله. من المهم أن نلاحظ أن مجال التحقيق يجب أن يكون محددًا بحذر ويجب تشريح الأنسجة المحيطة ب CNS بعناية من أجل تضمين الأوعية اللمفاوية الخارجية واللندق LNs التي تساهم في الدوائر اللمفاوية بأكملها(الجدول 2).
بالإضافة إلى الحجم والاعتبارات التشريحية ، يختلف تعقيد الأنسجة المينشية المحيطة على طول الجمجمة وعمود العمود الفقري ، مما يتطلب تكييف التشذيب والمعالجة المسبقة من أجل الحصول على توضيح عينة متجانسة والسماح بنشر شعاع الضوء داخل نسيج بيولوجي متجانس. في غياب العظام، التصوير LFSM من أنسجة المخ أو الحبل الشوكي لا يتطلب خطوة decalcification، والقرار النهائي للصور التي تم التقاطها هو الأمثل19. البروتوكول الموصوف أعلاه ، والذي يتضمن خطوة خفيفة decalcification مع حل مورس ، هو مكيفة بشكل جيد لLSFM التصوير من العمود الفقري كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 4. في المقابل، منطقة الرقبة يعرض تشريح العظام معقدة بشكل خاص بالإضافة إلى طبقات متعددة من العضلات والدهون والأنسجة الغدية، والتي تقلل من جودة الصور LSFM القبض، كما ينعكس في الشكل 3B. وهكذا يمكن تحسين التصوير LSFM من منطقة العنق وعنقها من خلال معاملة أكثر صرامة من الأنسجة; على سبيل المثال، مع EDTA، كما ذكر سابقا24. وبالتالي فإن خطوة التصميم هي شروط حرجة ويجب اختبارها مسبقًا لكل جسم مضاد يستخدم قبل بدء iDISCO+ البروتوكول الكامل(الجدول 2).
في حين أن بروتوكول iDISCO+/LSFM يسمح بتوليد عرض ثلاثي الأبعاد للدوائر التي تربط بين المساحات السحاية والمساحات فوق الجافية واللونات LNs المرتبطة بها ، التحليل الكمي المباشر للأوعية اللمفاوية من الصور التي تم التقاطها LSFM غير ممكن للأسباب التالية: 1) ترسيم دوائر الأوعية اللمفاوية غير موثوق بها بسبب النمط غير المتبقى للتعبير علامة اللمفاوية، لأن membranar LYVE1 هو هنا توزعت21 وPROX1 لديها نمط التعبير النووي22؛ 2) اختراق heterogenous من الأجسام المضادة، فضلا عن الانيسونروبيا التي قد تستمر في الأنسجة البيولوجية بسبب decalccification غير مكتملة وهئية وpreclearing. وهكذا يحتاج التصوير LSFM إلى توسيعه بأدوات الواقع الافتراضي التي تمكن من التصور التفاعلي وبالتالي تسهيل القياس الكمي للأوعية اللمفاوية (www.syglass.io). ومن الجدير بالذكر أيضا أن الوصف الدقيق للدوائر المرتبطة ب CNS يتطلب النسخ الاحتياطي معلومات LSFM مع بيانات التقاء عالية الدقة التي تم الحصول عليها من قبل مناعة التقليدية على رقيقة (5-10 ميكرومتر) اقسام اضماب الأنسجة أو البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة، خاصة لتوطين على وجه التحديد موقف الأوعية اللمفاوية فيما يتعلق بماطر دورا و CSF، كما ذكرت سابقا11،14،18.
يسمح بروتوكول iDISCO+/ LSFM بالتصور ثلاثي الأبعاد للصرف الجزيئي الكلي في الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS ، كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4. ومع ذلك ، يتطلب التقييم الوظيفي للصرف اللمفاوي ، بالإضافة إلى التوصيات الواردة على بروتوكول iDISCO+/ LSFM المفصل أعلاه ، بعد إجراء صارم ، حيث تعتمد النتيجة النهائية على جودة جراحة الحقن ، واختيار موقع التسليم ، ونوع وحجم حقن علامة الجزيئات الصغيرة المستخدمة ، ووقت التضحية بعد إدارة التتبع(الجدول 2).. بسبب الاختلافات في نمط التتبع بين الحيوانات المحقونة ، يتطلب توصيف دوائر الصرف اللمفاوي مجموعات تجريبية كبيرة (> 10 حسب حالة الحقن). في البروتوكول المقدمة، 1) يجب ثقب ماطر دورا قبل الحقن لمنع الآفات غير المرغوب فيها واختراق أنسجة الجهاز العصبي المركزي؛ 2) حجم حقن يجب أن يكون أقل من 2 ميكرولتر للحد من الانتشار غير المرغوب فيها من خلال ثقب الحقن، على طول الشعيرية حقن، في الفضاء فوق الجافية أو الأنسجة خارج الفقرات؛ 3) عمق حقن إدخال الشعيرات الدموية يجب أن تقتصر على 2 مم تحت ماطر دورا لتجنب إصابة CNS أو سوء التخطيط في ICM والحقن داخل باطن، على التوالي. لاحظ أيضا أن تحليلاً تكميلياً عالي الدقة للشرائح الفقرية المجاورة يحتاج إلى إجراء، كما هو مبين أعلاه، لتقييم وجود المقذّع المحقون داخل الأوعية اللمفاوية. يتطلب هذا التحليل إنشاء مخططات الملامح كثافة للمتتبع وعلامة اللمفاوية على أقسام عرضية من الأوعية اللمفاوية المسمى علامة. وقد سبق استخدام هذا النهج لإثبات امتصاص OVA555 من قبل اللمفيات ThLb في 15 دقيقة بعد الحقن (الشكل التكميلي 5F في يعقوب وآخرون14). ومع ذلك، لم يتم توضيحه لمتتبع مكافحة LYVE1 في هذه الدراسة(الشكل 4).
من بين التتبعات CSF المحتملة، OVA-A555 هو خيار ممتاز لأنه مقاوم لعلاجات iDISCO+ البروتوكول ويحافظ على الفلورسين عالية للتصوير LSFM. ومع ذلك، لاحظ أنه يجب اختيار نوع التتبع وفقًا لنقطة التحليل(الجدول 1 والجدول. 2). كما ذكر أعلاه، OVA-A555 وضع العلامات من الأوعية اللمفاوية الفقارية المحلية لوحظ في 15 دقيقة بعد الحقن14. ومع ذلك، لم يعد الكشف عن OVA-A555 في هذه الدوائر اللمفاوية المحلية في 45 دقيقة بعد الحقن (الشكل 3) على النقيض من الأجسام المضادة LYVE1 (الشكل 4).
في الختام ، يتم تكييف بروتوكول iDISCO+/ LSFM جيدًا للتحقيق في الهيكل ثلاثي الأبعاد والصرف في الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS في الحالات الفسيولوجية والمرضية مثل CNS وسرطان العمود الفقري ، أو أمراض العظام والفقارية والمفاصل. على الرغم من أن الإجراء الكامل طويل ويتطلب دقة منهجية ، فإنه يوفر معلومات قيمة وفريدة من نوعها عند استخدامها مع التحليل التكميلي باستخدام أدوات الواقع الافتراضي والتصوير confocal عالية الدقة.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم الطبية، والوكالة الوطنية للRcherche (ANR-17-CE14-0005-03)، الاتحاد من أجل إعادة التشيرش في سيرفو (FRC 2) 2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 نحن نعترف منصات ICM: ICM-QUANT للتصوير الخلوي و ICM-histomics للكيمياء المناعية. وقد أجريت جميع الأعمال الحيوانية في منشأة فينو ICMice. ويدعم الأساسية من قبل 2 “Investissements d’avenir” (ANR-10- IAIHU-06 و ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) و “مؤسسة من أجل recherche Médicale”. نحن نعترف نيكولاس رينييه للمشورة المنهجية وقراءة المخطوطات.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |