JoVE Journal > Immunology and Infection
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫学と感染

Driedimensionale beeldvorming van de wervellymfefelietische vasculatuur en drainage met behulp van iDISCO+ en Light Sheet Fluorescentie Microscopie

Published: May 22, 2020
doi:
10.3791/61099
, ,
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université,Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas,Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology,Yale University School of Medicine

概要

Een protocol wordt gepresenteerd combineren weefsel clearing met licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) om driedimensionale en cellulaire resolutie beelden van de lymfevaten en lymfeklieren (LN’ s) het verzamelen van de cerebrospinale vloeistof (CSF) en spinale epidurale vloeistof te verkrijgen.

Abstract

Het lymfestelsel geassocieerd met het centrale zenuwstelsel (CNS) omvat de lymfe vasculatuur die draait rond de hersenen, het ruggenmerg, en de bijbehorende LNs. Het cns-geassocieerde lymfestelsel is betrokken bij de drainage van CSF macromoleculen en meningeale immuuncellen in de richting van CNS-drainerende LNs, waardoor de klaring van afval en immuunsurveillance in CNS-weefsels wordt geregeld. Gepresenteerd is een nieuwe benadering van het verkrijgen van driedimensionale (3D) en cellulaire resolutie beelden van CNS-geassocieerde lymfotica met behoud van de integriteit van hun circuits binnen de omliggende weefsels. Het iDISCO+ protocol wordt gebruikt om lymfevaten in ontkalkte en gewiste hele mount preparaten van de wervelkolom die vervolgens worden afgebeeld met lichtblad fluorescentie microscopie (LSFM) immunolabel. De techniek onthult de 3D-structuur van het lymfenetwerk dat de meningeale en epidurale ruimten rond het ruggenmerg verbindt met extravertele lymfevaten. Voorzien zijn 3D-beelden van de drainage circuits van moleculaire tracers eerder geïnjecteerd in ofwel de CSF via de cisterna magna of de thoracolumbar spinale parenchyma. De iDISCO+/LSFM-aanpak biedt ongekende mogelijkheden om de structuur en functie van het cns-geassocieerde lymfestelsel in de neurovasculaire biologie, neuro-immuun- en wervelkanker, of wervelbot en gewrichtsbiologie te verkennen.

Introduction

Het CZS is omgeven door het CSF en overlegende lagen hersenvliezen, epidurale weefsel, en botten. Alles bij elkaar biedt het CSF fysieke bescherming aan de zachte hersenen en het ruggenmerg. Het wordt voornamelijk afgescheiden door de choroïde plexus en de meningeale membranen (d.w.z. de pia mater, de arachnoid en de dura mater). Het CSF-meningeal complex creëert ook een functionele interface tussen de CNS weefsels en de rest van het lichaam, waardoor bij te dragen aan CNS homeostase. Ten eerste dringt het CSF door het CNS parenchyma door de CNS para-arteriële ruimten en interageert dynamisch met de interstitiële vloeistof (ISF)1 via het glymfphatische (glia-lymfe) systeem, dat bestaat uit de paravasculaire ruimten en de astrocyten eindpootmembranen rond de CNS-schepen2,3,4. Metabolisch afval en overtollig vocht worden dan uiteindelijk gewist door intramurale perivasculaire drainage rechtstreeks van de hersenen parenchyma naar de systemische circulatie 3 ,evenalsde paraveneuze ruimten in de richting van het CSF en via brain-drainerende lymtische vaten, volgens de glymphatische model2,4. Csf-uitstroom verloopt voornamelijk via het lymfestelsel, via de cribriforme plaat en de bijbehorende extracraniële lymfevaten5,6,7 ,evenalsdoor de hersenlymfeklieren, die samenkomen bij de braintrainerende LN’s8,9,10,11,12 ( figuur1). Een belangrijke, hoewel secundaire, rol bij csf-uitstroom wordt ingenomen door de craniale arachnoid villi, die de lacune van meningeale veneuze sinussen13penetreren.

De CFS drainage circuits zijn uitgebreid onderzocht door middel van experimentele benaderingen op basis van de injectie van gekleurde / fluorescerende tracers in het CNS of CSF, gevolgd door de beeldvorming van het patroon van de tracers in het CNS en door de organen en weefsels van het lichaam op verschillende tijdpunten na injectie13. Lange tijd werd de uitstroom van CSF beschouwd als uitsluitend en rechtstreeks genomen door de bloedcirculatie, door middel van arachnoid villi projecteren in vurale veneuze sinussen13. De csf-uitstroom wordt echter voornamelijk uitgevoerd door de lymfevaat, zoals onlangs is aangetoond door de dynamische beeldvorming van csf-geïnjecteerd tracertransport bij muizen9,10. De CSF-drainerende lymfevaten keren dan via de juiste subclavian ader terug naar de bloedbaan. Aanvullende approches hebben zowel extracraniële6,7,,13 en intracraniale9,10,1111,12 lymfeuitgangen van CSF-geïnjecteerde tracers gedetecteerd en suggereren dat het CSF wordt geabsorbeerd door twee lymfepaden, een externe en de andere inwendig aan de schedel en wervelkolom. Het grootste deel van csf-drainage komt snel voor door lymfatische vaten die zich rostraal, buiten de schedel in het neusslijmvlies bevinden, via kanalen van de cribriforme plaat van het ethmoïde bot3,6,13 en, caudally, buiten lumbosacrale wervelbotten door dorsolaterale routes die nog niet volledig zijn gekarakteriseerd7,14. Bovendien absorberen lymfevaten van de dura mater in de hersenvliezen van de schedel direct CSF en meningeale immuuncellen naar oerlymfecollectoren die de schedelbotten kruisen en verbinding maken met CNS-drainerende LNs12,14. Deze meningeale lymfevaten spelen een belangrijke rol in CNS pathofysiologie, omdat hersenvlieslymfatica worden veranderd bij veroudering en ook van invloed zijn op de uitkomst van neurologische hersenziekten, waaronder neurodegeneratie, neuro-ontsteking en hersenkanker15,16,17. Daarom kan de cns-geassocieerde lymfevaat (d.w.z. de oer- en perifere lymfevaten die het CSF aftappen) een veelbelovend nieuw doelwit zijn om CNS-ziekten bij de mens te bestrijden.

Convergente studies uitgevoerd met immunohistologie en hoge resolutie magnetische resonantie beeldvorming aangetoond dat de meningeale lymfevaat vasculatuur bestaat ook bij primaten, met inbegrip van gemeenschappelijke marmoset apen en mensen7,11,13. Bovendien zijn hersenlymfatische bloedvaten niet beperkt tot de schedel, maar breiden zich binnen de wervelkolom uit tot het oppervlak van spinale ganglia en rami13,18. Driedimensionale (3D) beeldvorming van de wervelkolomlymfolytica met behoud van de algehele anatomie van gelabelde wervel- en ruggegraatsmonsters, waaronder bovenliggende botten, spieren, ligamenten, evenals naburige viscerale weefsels, werd onlangs uitgevoerd14. Het iDISCO+ protocol19,20 werd gebruikt om de preparaten van de hele wervelkolom met lymfespecifieke antilichamen met lymbraanreceptor LYVE121 of de transcriptiefactor PROX122te immunolabelen . Beeldacquisitie en -analyse werden vervolgens uitgevoerd met light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) en de Imaris-software. LSFM zorgt voor snelle en minimaal invasieve 3D-beeldvorming van grote exemplaren door axiale opsluiting van verlichting, wat resulteert in verminderde fotobleekte en fototoxiciteit23.

De iDISCO+/LSFM-benadering maakt karakterisering van de verschillende lagen van durale en epidurale lymfevaten mogelijk, en de verbinding van deze vasculatuur met de extravertebrale lymfecircuits en de LN’s die de wervelkolom naburig zijn. Het protocol werd toegepast op weefsels die eerder met fluorescerende tracers werden geïnjecteerd om wervelkanaaldrainage aan te tonen. Het onderhavige document geeft details over de iDISCO+/LSFM-methodologie om de wervellymfefeatuur in beeld te brengen en illustreert de relevantie ervan voor CSF en epidural fluid drainage investigation.

Protocol

Alle in vivo procedures die in deze studie worden gebruikt, voldeden aan alle relevante ethische voorschriften voor dierproeven en onderzoek, overeenkomstig de Europese Gemeenschap voor richtlijnen voor experimenteel gebruik van dieren (L358-86/609EEG). De studie kreeg ethische goedkeuring van de Ethische Commissie van INSERM (n°20161111126651) en de Institutional Animal Care and Use Committee van ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière). 1. Voorbereiding Bereid de volgende dissectiegereedschappen voor op een operatie: scalpel (1), microforceps (2), tangen (1), dissectieschaar en Michel hechtclips. Bereid 26 G naalden (0,45 mm x 13 mm), 1 mL spuit en 10 μL microsyringe. Trek microcapillaries met een enkelvoudig protocol bij 67,5 °C met een glazen micropipettrekker. Bereid twee microcapillaries per injectie. Reagentia voorbereiden op beeldvorming van lymfedrainage(Tabel 1): Ovalbumine Alexa Fluor 555 conjugaat (OVA-A555, 2 mg/mL in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS]) en anti-LYVE1-antilichaam (1 mg/mL in 1x PBS). Antistoffen voorbereiden (tabel 1) voor iDISCO+. Gebruik voor primaire antilichamen anti-LYVE1-polyklonale antilichamen (1:1.600) en anti-PROX1 geit polyklonal IgG-antilichaam (1:2.000). Voor secundaire antilichamen, gebruik Alexa Fluor ezel anti-konijn-568, ezel anti-konijn-647, en ezel anti-geit-647 (1:2,000). 2. Chirurgie procedures voor intra-cisterna magna (ICM) en thoracolumbar (ThLb) injecties Bereiding van het dier voor chirurgie Gebruik volwassen mannelijke en vrouwelijke C57BL6/J muizen, 8-12 weken oud. Injecteer de muis intraperitoneally (IP) met 0,015 mg/mL buprenorfineoplossing verdund in 0,9% natriumchloride bij 0,1 mg/kg, 15 min voor de operatie. Verdoven de muis in een inductiebox met 2-3% isoflurane gas. Bereiding van verdoofd dier voor tracerinjectie Plaats de verdoofde muis en het verwarmingskussen op het stereotaxic-apparaat. Gebruik de oorbalken om het hoofd van de muis vast te houden en leg het lichaam onder een hoek van ~ 135° op het hoofd of immobiliseer het ruggenmerg op het ThLb-wervelniveau (Th12-L1) met een spinale adapter. Knijp de staart of de poot met de forcep om de efficiëntie van anesthesie te controleren. Injecteer IP 200 μL van 0,9% natriumchloride voor muishydratatie. Met behulp van een scalpel mes, maak een huid incisie, hetzij in de occipitale regio in de richting van het cervicale gebied voor ICM injectie, of op de ThLb wervelniveau (Th10-L3) voor injectie in de ThLb spinale parenchyma. Tracer injectie Gooi paracervical en paraspinale spieren die de nek en de kolom om het oppervlak van de dura mater, de buitenste laag van de hersenvliezen, te visualiseren. Accentueer zorgvuldig het centrale gebied van de dura mater en onderlegde arachnoid met een 26 G naald. Microcapillaire implantatie Snijd 2 mm van de glazen capillaire tip (zie stap 1.2) en gebruik vervolgens de microcapillaire die is aangesloten op een canule die is gekoppeld aan een 10 μL-spuit om 2−8 μL van het OVA-A555- of LYVE1-antilichaam aan tezuilen. Introduceer de microcapillaire in het mediale gebied van de dura mater onder een hoek van 30° voor ICM-injecties of 10° hoek voor ThLb-spinale injecties, en duw het naar 1,5 mm onder de dura mater.OPMERKING: Het ligament is doorboord, maar er wordt geen laminectomie uitgevoerd. Voeg 10 μL chirurgische lijm toe om de incisie rond de glazen haarvaten te sluiten en wacht tot deze is droog. Injecteer de fluorescerende tracer langzaam op 1 μL/min. Zodra het injectievolume is geleverd, moet u de capillaire gedurende 1 min op zijn plaats houden. Trek de microcapillaire in en voeg chirurgische lijm toe om het injectiegat te dichten. Postinjectie, sluit de huid incisies met hechtclips. Haal de muis uit het stereotaxic-apparaat en plaats deze in een postsurgery-opwarmingskamer bij 37 °C totdat deze zich herstelt. 3. Perfusie en weefseldissectie Injecteer IP 15 min of 45 min na csf-tracerinjectie een dodelijke dosis (100 μL) natriumpentobarbital. Knijp de staart of de poot om te controleren of er geen reflex is. Snijd met een schaar de huid en open de buikvlieslaag van het onderbuikgebied naar de thoracale kooi. Open de thoracale kooi met een schaar om toegang te hebben tot het hart. Steek de 26 G naald in de linker ventrikel van het hart en begin te doordringen met 20 mL ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS op 2 mL/min. Gebruik een schaar om snel het rechter atrium te snijden en de perfusievloeistofstroom los te laten. Verwijder de huid volledig met tangen en snijd de vier poten met een schaar. Verwijder alle inwendige organen, maar wees voorzichtig om de LNs intact te houden.OPMERKING: Mandibulaire LNs zijn oppervlakkig, dus zorg ervoor dat ze niet verwijderen bij het afsnijden van de huid. Deep-cervicale LNs (dcLNs) bevinden zich aan weerszijden van de luchtpijp, in contact met het laterale oppervlak van de interne halsaders en dicht bij de stereomastoïde spieren. Snijd de ribben om de wervelkolom te verwijderen met het ruggenmerg binnen van de cervicale tot de lendensegmenten. Dompel de ontleed weefsels in ijskoude 4% PFA in 1x PBS in een 50 mL buis ‘s nachts (~ 18 uur) bij 4 °C. Was de vaste weefsels 3x in 50 mL van 1x PBS gedurende 5 minuten. 4. Fluorescentiemacropie van een wervelsegment Plaats het monster onder de fluorescentie stereozoom microscoop met een camera (Tabel van materialen). Neem een overzicht van het voorbeeld of zoom op een bepaald gebied. 5. Monstervoorbereiding voor hele immunostaining Met behulp van een microtomeblad snijdt u de kop- en wervelkolom transversaal op het occipiiële en cervicale niveau.OPMERKING: Deze dissectie maakt isolatie van het hoofd en het halswervelgebied van de rest van de wervelkolom mogelijk. Snijd met een microtomeblad de cervicale, thoracolumbar en sacrale gebieden van de wervelkolom transversaal in segmenten van 2−4 wervels, elk ongeveer 0,5 cm groot. Isoleer elk segment in de volgorde waarin het werd gescheiden van de wervelkolom, over de gehele lengte van de cervicale en thoracale gebieden van de wervelkolom. Bewaar elk monster in een buis van 2 mL 1x PBS. 6. iDISCO+ hele mount immunostaining van een wervelsegment LET OP: De gedetailleerde beschrijving van het iDISCO+ protocol is toegankelijk op http://www.idisco.info. Dag 1: Weefseldehydratie Dehydrateren wervelweefsel monsters (dat wil zeggen, een wervelsegment) door opeenvolgende onderdompeling in 20%, 40%, 60%, 80%, en 100% methanol in 1x PBS voor 1 uur met agitatie. Incubeer de monsters ‘s nachts in een oplossing van 33% methanol/66% dichloormethaan (DCM) bij kamertemperatuur (RT) met agitatie. Dag 2: Weefselbleken Was monsters 2x met 100% methanol gedurende 1 uur bij RT. Incubate de monsters in 5% H2O2 in methanol (30% H2O2 en methanol 1:5 v/v) bij 4 °C ‘s nachts. Dag 3: Decalcification en permeabilisatie stap Rehydrateer de monsters geleidelijk in 80%, 60%, 40%, 20% methanol, vervolgens in 1x PBS (1 h in elke oplossing) bij RT met agitatie. Ontkalken de wervels door monsters in Morse’s oplossing (10% trinatriumcitraat en 45% mierenzuur 1:1 v/v) gedurende 30 min in RT uit te broeden om de botstructuur te behouden. Spoel de monsters 2x met 1x PBS en incubeer 2x voor 1 uur in PTx2 oplossing (0,2% Triton X-100 in 1x PBS, vernieuwen voor de tweede incubatie) bij RT met agitatie. Vervolgens de voorbehandelde monsters in permeabilisatieoplossing (PTx2 met 20% dimethylsulfoxide [DMSO] en 2,3% w/v glycine) bij 37 °C gedurende 24 uur incubeer worden geïncubeerd. Dag 4: Stap blokkeren Incubeermonsters in blokkeeroplossing (PTx2 met 6% ezelserum en 10% DMSO) bij 37 °C voor 24 uur. Dag 5−16: Hele mount immunolabeling Incubatemonsters in primair antilichaam verdund in PTwH (1x PBS met 0,2% Tween-20 en 0,1% heparine bij 10 mg/mL in 1x PBS) met 5% DMSO/3% ezelserum bij 37 °C gedurende 6 dagen. Was monsters 4−5x in PTwH bij RT met agitatie ‘s nachts. Incubeermonsters bij secundaire antilichaamverdunningen in PTwH met 3% ezelserum bij 37 °C gedurende 4 dagen. Was monsters in PTwH 4−5x bij RT onder agitatie ‘s nachts voor het opruimen. Dagen 17 en 18: iDISCO+ weefselclearing Dehydraatmonsters geleidelijk door opeenvolgende onderdompeling in 1x PBS, dan 20%, 40%, 60%, 80%, en 2x in 100% methanol (1 uur in elke oplossing). Incubeer elk monster ‘s nachts in een oplossing van 33% methanol/66% DCM. Was 2x in 100% DCM gedurende 15 minuten om de methanol te verwijderen. Incubeer in dibenzylether (DBE) zonder te schudden tot het gewist is (4 uur) en sla vervolgens op in DBE bij RT voordat beeldvorming. 7. LSFM-beeldvorming Beeld gewist monsters in een transversale vlak met de LSFM uitgerust met een 4x/0.3 doelstelling. Gebruik een enkelezijdige drie bladverlichting configuratie, vaste x positie (geen dynamische scherpstelling). Gebruik LED-lasers afgestemd op 561 nm, 100 mW; en 639 nm, 70 mW. Stel het numerieke diafragma van de lichtplaat in op 30%. Gebruik verschillende emissiefilters: 595/40 voor Alexa Fluor-568 of -555 en -680/30 voor Alexa Fluor-647. Vul de microscoopkamer met DBE. Aquire stapelt met stappen van 2,5 μm z en een belichtingstijd van 30 ms per stap met de camera(Tabel van materialen). Gebruik de x2 optische zoom voor een effectieve vergroting van (x8), 0,8 μm/pixel en voer de mozaïekacquisities uit met een overlap van 10% op het volledige frame. Verwerf afbeeldingen in .tif-formaat met acquisitiesoftware en zet ze om naar 3D-formaat met een bestandsconversiesoftware. Reconstrueren mozaïeken overname met stitcher software (Tabel van materialen). Open de afbeeldingen en beweeg handmatig om het hele mozaïekbeeld opnieuw samen te stellen, met behulp van de overlap van 10% tussen afbeeldingen als richtlijn. Gebruik de 3D-software(Tabel van materialen) om orthogonale projecties van gegevens te genereren, zoals weergegeven in figuur 1, figuur 2, figuur 3en figuur 4, en voeg een kenmerk van kleurcode toe aan de lymfevaten en de andere anatomische structuren die worden weergegeven. Stel een gammacorrectie van 1,47 in op de ruwe gegevens die volgens de instructies van de fabrikant zijn verkregen uit de LSFM.

Representative Results

3D beeldvorming van de wervellymfefefaat vasculatuurFiguur 1 presenteert de stappen van de iDISCO+/LSFM-procedure en een LSFM-beeld van lymfecircuits in het wervelkanaal van iDISCO+behandelde ThLb-wervels. De combinatie van iDISCO+ met LSFM bewaarde de wervelanatomie en veroverde een beeld van het lymfevale vaatnetwerk (d.w.z. de intravertebrale bloedvaten verbonden met de extravertebrale bloedvaten die dorsaal en lateraal uit het wervellichaam vergaan) in de omliggende botten, ligamenten, spieren en zenuwganglia. Fluorescentie macroscopie beeldvorming van dcLN drainageOm macromolecule drainage in het CNS-geassocieerde lymfestelsel in beeld te brengen, werden macromoleculaire tracers in vivo beheerd door injectie in het CSF of het ruggenmerg parenchyma. Een macromoleculaire tracer kan gemakkelijk worden geleverd in het CSF op de cisterna magna. De cisterna magna bevindt zich tussen het cerebellum en het rugoppervlak van de medulla oblongata, boven de foramen magnum. Macromoleculaire tracer kan ook worden geïnjecteerd in de spinale parenchyma door stereotactische chirurgie op verschillende niveaus langs de wervelkolom. De gebruikte macromoleculaire tracers werden ofwel rechtstreeks gelabeld met een fluorofof of ontdekt postmortem door immunohistochemie met specifieke antilichamen. Figuur 2A illustreert het experimentele plan voor het volgen van OVA-A555, een rode fluorescerende en kleine moleculaire gewichtstracer (ongeveer 45 kDa), dat werd geïnjecteerd in het CSF (Figuur 2B) of de ThLb-regio van het ruggenmerg (figuur 2C). Op 45 minuten na de macromoleculaire tracer injectie, werden de muizen geofferd, geperfundeerd met 4% PFA, en verwerkt om ontleed segmenten van de hersenstam regio van het hoofd en de wervelkolom die werden ontkalkt en verduidelijkt te isoleren. Macromolecule drainage werd vervolgens gemakkelijk beoordeeld door fluorescentie macroscopie beeldvorming van de LNs die het CSF en epidurale vloeistoffen te verzamelen. Zoals blijkt uit figuur 2,ova-a555 injectie in ofwel de CSF (Figuur 2B) of de ThLb (Figuur 2C) regio van het ruggenmerg resulteerde in OVA-A555 accumulatie in de dcLNs op 45 min na injectie. Deze observatie geeft de opname en drainage van fluorescerende tracer door het lymfestelsel aan; het is een voorwaarde voor het nastreven van de iDISCO+/ LSFM procedure om het beeld van de wervellymfedrainage. 3D-beeldvorming van macromolecule drainage in het wervellymfestelselOp basis van de detectie van OVA-A555-etikettering in dcLN’s, kan de iDISCO+/LSFM-procedure worden toegepast op ontkalkte en voorgeclearde wervelmonsters geïsoleerd van OVA-A555-geïnjecteerde muizen. Deze aanpak kon de creatie van een 3D-kaart van de lymfedrainage van CSF en spinale epidurale vloeistof op een specifiek tijdstip na tracer injectie. Deze 3D-mapping kan worden uitgevoerd door opeenvolgende CNS-segmenten, op elk niveau van de wervelkolom, vanaf het injectiepunt te beeldvorming. Figuur 3A toont het experimentele ontwerp voor OVA-A555-injectie in het ThLb-spinale parenchyma en het resulterende 3D-patroon van OVA-A555-verdeling in een cervicale en een thoracale wervelsegment, in combinatie met de lymfevaat. Op 45 minuten na ova-a555 injectie, OVA-A555 accumulatie werd gedetecteerd in ruggenmergweefsels en dcLN ‘s (witte pijlen in figuur 3B), in overeenstemming met microscoop waarnemingen geïllustreerd in figuur 2. Het werd echter niet gedetecteerd in de cervicale en thoracale lymfevaat vasculatuur gelabeld met anti-LYVE1 antilichamen. De afwezigheid van csf-geïnjecteerde tracer in de wervellymfevaten kan te wijten zijn aan ofwel een korte persistentietijd van tracer in lymfevaten of een gebrek aan opname van de tracer door de lymfevaten(figuur 3C). Om de eerste hypothese te testen, werd het anti-LYVE1-antilichaam van het konijn gebruikt als een lymtische endotheelceltag om CNS-geassocieerde lymfevaten te binden. Het geïnjecteerde konijn anti-LYVE1 antilichaam werd daarna ontdekt door immunohistochemie met een anti-konijn secundaire antilichaam, terwijl lymfe endotheelcellen werden immunolabeled met anti-PROX1 antilichamen. Figuur 4 vertegenwoordigt het experimentele ontwerp van anti-LYVE1-injectie in het ThLb-spinale parenchyma (figuur 4A), en het resulterende 3D-distributiepatroon van LYVE1-antilichamen in een ThLb-segment dicht bij de injectieplaats, met betrekking tot PROX1+ lymfotica (figuur 4B). Zowel wervellymfatische lymfaten als hun extravertebrale lymfatische verbindingen werden gelabeld door geïnjecteerde anti-LYVE1-antilichamen, die de opname van de tracer onderbouwden door wervellymferemtische bloedvaten en de lymfedrainage naar het extravertebrale lymfestelsel. LNs ontbraken in de ThLb-regio en konden dus niet worden gevisualiseerd in het beeldsegment. Bovendien weerspiegelde het discontinu patroon van LYVE1-marker die langs lymfevaten wordt waargenomen waarschijnlijk de discontinu expressie van LYVE1 in de lymfevaat, zoals gemeld in eerdere studies14,21. In totaal toonden de resultaten van deze studie aan dat LYVE1-antilichaam, maar niet OVA-A 555, op 45 minuten na de injectie van LYVE1, maar niet OVA-A555,de lokale lymfeklieren kon detecteren en de voorkeur kreeg boven OVA-A555 als een aanhoudende marker van lokale wervellymfedrainage. Figuur 1: Driedimensionale weergave van de wervellymfefevaat vasculatuur. (A) Schematische weergave van het protocol. (B) Planaire projectie van een 3D-weergave van de ThLb wervellymfefevaat vasculatuur vanuit een dorsofrontale perspectief. Lymfevaten werden immunolabeled met het anti-PROX1 antilichaam (groen) met behulp van de iDISCO+ protocol en vervolgens afgebeeld door LSFM. Let op het metameric-achtige patroon van de vasculatuur in het wervelkanaal van drie opeenvolgende wervels (witte pijlpunten). Naast halfronde rugvaten (witte pijlpunten), omvatte elk wervelnetwerk ventrale takken (gele pijlen), bilaterale zijuitgangsroutes langs de spinale rami en ganglia (witte pijlen), evenals een dorsale uitgangsroute bij de middellijn (witte dubbele pijl). Wervelnetwerken waren verbonden met een longitudinaal vat (paarse pijlen). Voor een volledige beschrijving, zie Jacob L. et al.18 SC = ruggenmerg; Sterretje = ventrale wervellichaam; D = dorsale; L = zijwaarts; V = ventral; Schaalbalken = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: dcLNs verzamelden OVA-A555-gelabeldeCSF Fluids. aA) Schema van het experimentele ontwerp. OVA-A555 werd geïnjecteerd in ofwel de ICM of de ThLb spinale parenchyma, dan muizen werden geofferd 45 min na injectie. De monsters werden gewist en waargenomen door fluorescentie macroscoop beeldvorming (B,C). Fluorescentie macroscoop beelden van cervival wervels van ICM- (B) en ThLb- (C) geïnjecteerd muizen. Merk op dat OVA-A555 zich ophoopte in de dcLNs(B,C, witte pijlpunten), de pial en paravasculaire ruimten van het cervicale ruggenmerg (B,C) en na ICM-injectie, in ventrolaterale uitgangsroutes, waarschijnlijk langs cervicale zenuwen (B, witte pijlen). SC = ruggenmerg. Sterretje = ventrale wervellichaam; D = dorsale; L = zijwaarts; V = ventral; Schaalbalken in B en C = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Detectie van OVA-A555-gelabeldeCSF-vloeistoffen in het wervellymfestelsel. aA) Schema van het experimentele ontwerp. OVA-A555 werd geïnjecteerd in de ThLb spinale parenchyma, dan muizen werden geofferd op 45 min na injectie. De monsters werden behandeld met het iDISCO+ protocol en afgebeeld met een LSFM. (B,C) Vlakke projecties van LSFM-gevangen frontale 3D-weergaven van cervicale (B) en thoracale (C) wervelkolom segmenten. OVA-A555 accumulatie (rood) werd gedetecteerd in ruggenmergweefsels en dcLN’s(B, witte pijl), zoals geïllustreerd in figuur 2, maar niet in de cervicale en thoracale lymfe vasculatuur immunolabeled hier met anti-LYVE1 antilichamen (groen). SC = ruggenmerg; Sterretje = ventrale wervellichaam; D = dorsale; L = zijwaarts; V = ventral; Schaalbalken = 1 mm (B), 300 μm (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: Detectie van wervellymfedrainage na intraspinale injectie van anti-LYVE1-antilichamen. aA) Schema van het experimentele ontwerp. Anti-LYVE1 antilichamen werden geïnjecteerd in de ThLb spinale parenchyma, vervolgens muizen werden geofferd 45 min na injectie. De monsters werden behandeld met het iDISCO+ protocol en afgebeeld met een LSFM. (B). Planaire projecties van frontale 3D-weergaven van een ThLb (B) wervelkolom segment, gevangen met een LSFM. Anti-LYVE1 antilichamen werden gedetecteerd met anti-konijn antilichamen (paars) en de lymfe vasculatuur met anti-PROX1 antilichamen (groen). Witte vaten zijn PROX1+ lymfotica colabeled met anti-LYVE1 antilichamen(B); deze omvatten wervels (gele pijlen) en extravertebrale (dubbele gele pijlen) lymfeklieren. SC = ruggenmerg; Sterretje = ventrale wervellichaam; D = dorsale; L = zijwaarts; V = ventral; Schaalbalken = 300 μm (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Reagentia Doel Figuur Protocolstap Commentaar OVA-A555 CSF-tracer Figuur 2 en figuur 3 2. ICM- of ThLb-injectie7. LSFM beeldvorming. In water oplosbaar, gemakkelijk te injecteren en hoge intense fluorescentie Anti-Lyve1-antilichaam Membraanmarkering van LVs-cellen Figuur 3 6. iDISCO+ hele mount immnunostaining.7. LSFM beeldvorming. Efficiënt antilichaam tegen hele mount immnunostaining Tracerdrainage van de durale en epidurale LVs Figuur 4 2. ICM- of ThLb-injectie6. iDISCO+ hele mount immnunostaining7. LSFM-beeldvorming Anti-Prox1 antilichaam Nucleaire marker van LVs cellen Figuur 1 en figuur 4 6. iDISCO+ hele mount immnunostaining7. LSFM-beeldvorming Efficiënt antilichaam tegen hele mount immnunostaining Tabel 1: Antilichamen en tracers die in het onderzoek worden gebruikt. Probleem Mogelijke reden Oplossing Chirurgie voor tracerinjectie Ongewenste CNS-weefsellaesie 1. Gebrek aan controle op het inbrengen van glazen capillaire2. Onjuiste diepte van het inbrengen van glazen capillaire 1. Accentueer met zorg, maar volledig, de dura mater met een 26 G naald voor glas capillaire inbrengen.2. Verminder de diepte van het inbrengen van glazen capillaire (<1,5 mm van de dura mater).3. Verlaag de diameter van de glazen capillaire. Ongewenste defilement van geïnjecteerde tracer in de epidurale of extrawervelruimten Onjuiste injectie van tracer 1. Controleer of de glazen micro capillaire goed is ingebracht in het punctaat van de dura mater.2. Voeg chirurgische lijm tussen glas microcapillair en het omliggende weefsel voor het injecteren van tracer. Overmatig volume geïnjecteerde tracer Verminder het volume van de geïnjecteerde tracer (<2 μL). iDISCO+ immunostaining Afwezigheid, heterogeniteit of overmatige achtergrond van etikettering in het weefsel 1. Problemen met de concentratie van het primaire antilichaam2. Onvoldoende permeabilisatie3. Onvoldoende wassen4. Onvoldoende clearing Verhoog het aantal en/of de tijd van incubatiestappen: permebilisatie, whashing, primair antilichaam en clearing. Zie http://www.idisco.info (faq en probleemoplossing). Onvoldoende ontkalking Gebruik een strengere ontkalkingsbehandeling van monster met EDTA21- of Morse-oplossing voor vooral hoofdweefsels. iDISCO+ clearing Monsters zijn ondoorzichtig of bruin gekleurd Onvoldoende bleken Gebruik een verse H2O2-oplossing, verhoog het volume en/of de incubatietijd. Aanwezigheid van oxidatie Vul de buis volledig om de aanwezigheid van lucht te voorkomen. Onvoldoende clearing Verhoog het volume en/of de incubatietijd. Zie http://www.idisco.info (faq en probleemoplossing). Tracerdetectie Niet op te sporen tracer Onjuiste combinatie van de geselecteerde tracer Alexa 555, 594 en 647 fluorchromen zijn bestand tegen iDISCO+ protocol5,6,,7,8,9,10. Dit is echter niet het geval voor FITC, GFP, RFP fluorchromen. Opofferingstijdpunt na injectie Geef de voorkeur aan OVA-A555 voor korte termijn (15 min) drainageanalyse in lokale wervellymfolytica. Voor lymfeklieren drainage analyse, OVA-A555 en Lyve1 antilichaam kan worden gebruikt voor de langere termijn (>45 min) analyse. Beeldvorming: vastleggen en analyseren Vastgelegde beelden van het lymfecircuit zijn niet bevredigend Dissectie probleem (lymfeklieren ontbreken) Neem zorgvuldig de wervel / schedel naburige weefsels in uw ontleed monster, volgens de lymfekring die u wilt beeld. Beeldvormingsprobleem 1. Wijzig de acquisitieparameters van de LSFM: laserintensiteit, lichtplaat numeriek diafragma, dikte van de lichtplaat, expositietijd.2. Plaats het monster in de steun om het pad dat door licht door het weefsel wordt afgelegd tot aan het doel te verminderen.3. Zorg ervoor dat er geen bellen in het weefselmonster zitten tijdens de verwerving. Tabel 2: Advies voor het oplossen van problemen voor elke stap van het protocol, inclusief mogelijke problemen en oplossingen.

Discussion

Het iDISCO+/LSFM-protocol biedt ongekende 3D-weergaven van het cns-geassocieerde lymfenetwerk binnen de omliggende weefsels op een cellulair resolutieniveau. Dit protocol is goed aangepast aan middelgrote monsters, niet exeeding 1,5 cm3, als gevolg van de beperkingen van het LSFM optische systeem, de verminderde werkafstand, en de grote omvang van de commerciële objectieve lenzen voor hoge resolutie microscopie23. Deze beperking voorkomt het vastleggen van de hele hersenen-geassocieerde lymfestelsel. Het is belangrijk op te merken dat het onderzoeksgebied voorzichtig moet worden afgebakend en dat de weefsels rond het CZS zorgvuldig moeten worden ontleed om de extracraniële lymfevaten en LNs op te nemen die bijdragen aan het hele lymfecircuit(tabel 2).

Naast grootte en anatomische overwegingen varieert de complexiteit van omliggende mesenchymale weefsels langs de schedel en de wervelkolom, wat aanpassing van de ontkalking en preclearing behandeling vereist om een homogene monsterverduidelijking te verkrijgen en lichtbundel voortplanting binnen een zacht isotropisch biologisch weefsel mogelijk te maken. Bij afwezigheid van botten vereist LFSM-beeldvorming van de hersenen of ruggenmergweefsels de ontkalkingsstap niet en is de uiteindelijke resolutie van de vastgelegde beelden optimaal19. Het hierboven beschreven protocol, dat een milde ontkalkingsstap met morse’s oplossing omvat, is goed aangepast voor LSFM-beeldvorming van de wervelkolom zoals geïllustreerd in figuur 1 jp figuur 4. In tegenstelling, de nek regio toont een bijzonder complexe bot anatomie in aanvulling op meerdere lagen van spieren, vet en klierweefsels, die de kwaliteit van de vastgelegde LSFM beelden te verminderen, zoals weerspiegeld in figuur 3B. LSFM beeldvorming van de nek en cervicale gebied kan dus worden verbeterd door een strengere behandeling van weefsels; bijvoorbeeld met EDTA, zoals eerder gemeld24. De ontkalkingsstap is daarom kritiek en de ontkalkingsvoorwaarden moeten eerder worden getest voor elk antilichaam dat wordt gebruikt voordat het volledige iDISCO+ protocol(tabel 2)wordt gestart.

Hoewel het iDISCO+/LSFM-protocol het mogelijk maakt om een 3D-weergave te maken van verbindingscircuits tussen de meningeale en epidurale ruimten en de bijbehorende LN’s, de directe kwantitatieve analyse van lymfevaat van lsfm-gevangen beelden is om de volgende redenen niet haalbaar: 1) afbakening van lymfevatcircuits is onbetrouwbaar vanwege het discontinu patroon van lymfemarkeringsexpressie, omdat membranar LYVE1 erfelijk verdeeld is21 en PROX1 een kernexpressiepatroonheeft 22; 2) de heterogene penetratie van antilichamen, evenals de anisotropie die kan aanhouden in het biologische weefsel als gevolg van onvolledige en heterogene ontkalking en preclearing. LSFM beeldvorming moet dus worden uitgebreid met virtual reality tools die interactieve visualisatie mogelijk maken en zo kwantificering van de lymfevaat (www.syglass.io) vergemakkelijken. Het is ook opmerkelijk dat de precieze beschrijving van het cns-geassocieerde circuit een back-up van LSFM-informatie vereist met confocale gegevens met hoge resolutie die zijn verkregen door conventionele immunolabeling op dunne (5-10 μm) cryostat of paraffine-embedded weefselsecties, met name om de positie van lymfevaten met betrekking tot de dura mater en het CSF nauwkeurig te lokaliseren, zoals eerder gemeld11,14,18.

Het iDISCO+/LSFM-protocol maakt een driedimensionale visualisatie van de macromoleculaire drainage in het cns-geassocieerde lymfestelsel mogelijk, zoals geïllustreerd in figuur 3 jp figuur 4. De functionele beoordeling van de lymfedrainage vereist echter, naast de aanbevelingen over het hierboven beschreven iDISCO+/LSFM-protocol, na een rigoureuze procedure, omdat het uiteindelijke resultaat afhangt van de kwaliteit van de injectieoperatie, de keuze van de leveringslocatie, het type en het geïnjecteerde volume van de gebruikte macromolecule marker en het tijdstip van opoffering na traceradministratie (tabel 2). Als gevolg van variaties van het tracerpatroon tussen geïnjecteerde dieren, vereist de karakterisering van lymfedrainagecircuits grote experimentele groepen (>10 door injectieconditie). In het gepresenteerde protocol 1) moet de dura mater vóór de injectie worden doorboord om ongewenste laesies en penetratie in de CNS-weefsels te voorkomen; 2) het geïnjecteerde volume moet minder dan 2 μL bedragen om ongewenste verspreiding door het injectiegat, langs de injectiecapillaire, in de epidurale ruimte of extravertebrale weefsels te beperken; 3) de diepheid van het inbrengen van injectiecapillaire middelen moet worden beperkt tot 2 mm onder de duramater om cns-letsel of mistargeting in respectievelijk ICM en intraspinale injecties te voorkomen. Merk ook op dat een aanvullende confocale analyse met hoge resolutie van naburige wervelsegmenten moet worden uitgevoerd, zoals hierboven aangegeven, om de aanwezigheid van geïnjecteerde tracer in de lymfevaten te beoordelen. Deze analyse vereist het vaststellen van de intensiteitsprofielpercelen voor de tracer en de lymfemarker op dwarsdoorsnedes van lymfevaten met het markerlabel. Deze aanpak is eerder gebruikt om ova555 opname door ThLb lymfolytica aan te tonen op 15 min na injectie (aanvullende figuur 5F in Jacob et al.14). In deze studie is echter niet aangetoond dat de anti-LYVE1-tracer in deze studie is aangetoond (figuur 4).

Onder mogelijke CSF tracers, OVA-A555 is een uitstekende optie omdat het bestand is tegen de iDISCO+ protocol behandelingen en onderhoudt hoge fluorescentie voor LSFM beeldvorming. Houd er echter rekening mee dat het type tracer moet worden gekozen overeenkomstig het analysetijdpunt(tabel 1 jp tabel 2). Zoals hierboven vermeld, wordt OVA-A555 etikettering van lokale wervellymfelyserende vaten waargenomen op 15 minuten na injectie14. OVA-A555 wordt echter niet meer gedetecteerd in deze lokale lymfecircuits op 45 minuten na injectie (figuur 3) in tegenstelling tot het anti-LYVE1-antilichaam (figuur 4).

Tot slot is het iDISCO+/LSFM-protocol goed aangepast voor het onderzoeken van de 3D-structuur en drainage van het cns-geassocieerde lymfestelsel in fysiologische en pathologische aandoeningen zoals CNS- en wervelkolomkanker, of wervelbot- en gewrichtsziekten. Hoewel de volledige procedure lang is en methodologische strengheid vereist, biedt het waardevolle, unieke informatie wanneer het wordt gebruikt met aanvullende analyse met behulp van virtual reality-tools en confocale beeldvorming met hoge resolutie.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (to L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ voor J.B.), NIH (R01EB016629-01) en de Yale School of Medicine. Wij erkennen de ICM-platforms: ICM-QUANT voor cellulaire beeldvorming en ICM-histomics voor immunohistochemie. Al het dierwerk werd uitgevoerd in de PHENO-ICMice faciliteit. De Kern wordt ondersteund door 2 “Investissements d’avenir” (ANR-10- IAIHU-06 en ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) en de “Fondation pour la Mé Recherchedicale”. Wij erkennen Nicolas Renier voor methodologisch advies en manuscriptlezing.

Materials

Consumables
Centrifuge tubes: 0.2ml Eppendorf 30124359
Centrifuge tubes: 2ml Eppendorf 30120094
Conical centrifuge tubes: 15ml Falcon 352096
Conical centrifuge tubes: 50ml Falcon 352070
Microtome blade 80mm Microm Microtech France F/MM35P
Needles 26G (0.45×13 mm) Terumo AN*2613R1
Syringe 1ml Terumo SS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera Zeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion COHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit Thermo Fisher A10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat Jackson ImmunoResearch 705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibody Angiobio #11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody R&D systems #AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) Animalcare Ampule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE) Sigma Aldrich 108014
Dichloromethane 100% (DCM) Sigma Aldrich 270997
Formic acid 99% CARLO ERBA 405793
Glycine Sigma Aldrich G.7126
Heparine sodium salt from porcine Sigma Aldrich H4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) Sigma Aldrich H1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%) Piramal NDC 66794-013-10
Methanol 100% Sigma Aldrich 322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate Invitrogen 11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) Euromedex ET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) Dechra 08718469445110
Tri-sodium citrate VWR 6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia system Univentor Univentor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette puller Narishige PC-10
Heating pad CMA Microdialysis AB CMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries) Harvard Apparatus GC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) Fine Science Tool 12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) Swann-Norton 0510
Stereotaxic apparatus KOPF Model 940
Syringe Hamilton 10µl 701N Hamilton 28618-U
Warm air System Vet-Tech LTD HE011
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  2. Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977 (2015).
  3. Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
  4. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
  5. Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer’s Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
  6. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
  7. Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  11. Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
  12. Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  13. Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
  14. Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
  15. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  16. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  17. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  18. Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
  19. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  20. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  21. Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  23. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).

タグ

3D ImagingVertebral Lymphatic VasculatureLymphatic DrainageIDISCO+ ClearingLight Sheet Fluorescence MicroscopySpinal CordMeningesEpidural SpaceDraining Lymph NodesFluorescent TracerPerfusionAnatomical Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61099, doi:10.3791/61099 (2020).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image