提出了一种将组织清除与光片荧光显微镜 (LSFM) 相结合的协议,以获得收集脑脊液 (CSF) 和脊柱硬膜外液的淋巴血管和淋巴结 (LNs) 的三维和细胞分辨率图像。
与中枢神经系统 (CNS) 相关的淋巴系统包括围绕大脑、脊髓及其相关 LNs 旋转的淋巴血管。与CNS相关的淋巴系统参与CSF大分子和脑膜免疫细胞的排水,以向中枢神经系统排水的LN,从而调节中枢神经系统组织内的废物清除和免疫监测。呈现是一种新方法,可获取中枢机相关淋巴的三维(3D)和细胞分辨率图像,同时保持其周围组织内回路的完整性。iDISCO®协议用于免疫标记淋巴血管在分体和清除整个安装制剂的椎柱,随后用光片荧光显微镜 (LSFM) 成像。该技术揭示了淋巴网络的3D结构,将脊髓周围的脑膜和硬膜外空间与椎外淋巴血管连接。提供以前通过西斯特纳磁石或胸椎脊柱膜注入CSF的分子示踪剂的3D图像。iDISCO+/LSFM方法为探索中枢神经系统在神经血管生物学、神经免疫学、脑癌和椎癌、椎骨和关节生物学中的结构和功能带来了前所未有的机遇。+
CNS 被 CSF 包围,覆盖着脑膜、硬膜外组织和骨骼层。总之,CSF为软脑和脊髓提供身体保护。它主要由胆结丛和脑膜(即皮娅母体、气管和杜拉母体)分泌。CSF脑膜复合体还建立了中枢组织和身体其他部位之间的功能接口,从而有助于中枢平衡。首先,CSF通过CNS副动脉空间穿透CNS,并通过淋巴(胶质淋巴)系统与间质流体(ISF)1动态相互作用,该系统由半血管空间和中枢神经系统周围2、3、4,3的星形细胞端脚,膜组成。代谢废物和多余的液体,然后最终清除通过内部血管内排水直接从脑膜瘤到系统循环3,以及准静脉空间向CSF和通过脑排淋巴血管,根据淋巴模型2,4。42CSF流出主要是通过淋巴系统,通过颅骨板和相关颅外淋巴血管5,6,7,6,以及5通过脑膜淋巴血管,其中收敛在脑力流失的LNs 8,9,10,11,12(,9,10,11,12图1)。7在CSF流出中,一个重要,虽然次要,角色是由颅气管,它穿透脑膜静脉鼻窦13的乳腺。
CFS排水电路已通过实验方法广泛研究,基于注射彩色/荧光示踪剂到中枢或CSF,随后在注射13后的不同时间点对中枢系统内和整个身体器官和组织进行成像。长期以来,CSF的外流被认为是完全由血液循环直接负责的,通过阿拉奇诺德维利投射到硬静脉鼻窦13。然而,CSF流出主要是由淋巴血管进行,最近近红外(NIR)动态成像CSF注射的示踪仪在小鼠9,10。109CSF排空淋巴血管,然后通过右亚克拉维安静脉将淋巴返回血液。补充性表检已经检测到颅外6,7,13,7,13和颅内9,10,11,12,10,11淋巴出口CSF注射的示踪,并建议CSF被两个淋巴通路吸收,一个外部,另一个在头骨和椎柱的内部。,12CSF排水的主要部分迅速发生通过淋巴血管位于玫瑰,在鼻粘膜的头骨外,通过通道的三叶草骨3,6,13,6,和,从口头上,通过尚未完全定性的7,14,14的淋巴脊道外。此外,在头骨的脑膜,杜拉母体直接吸收CSF和脑膜免疫细胞到支形淋巴收集器,穿过头骨,连接到CNS排水的LNs12,14。12,14这些脑膜淋巴血管在中枢神经系统病理生理学中扮演着重要角色,因为脑脑脑膜淋巴在老化时改变,也影响神经性脑疾病的结果,包括神经退化、神经炎和脑癌15、16、17。15,16,17因此,与CNS相关的淋巴血管(即排出CSF的硬部和周围淋巴血管)可能是对抗人类中枢神经系统疾病的有希望的新目标。
与免疫希学和高分辨率磁共振成像进行的融合研究表明,脑膜淋巴血管也存在于灵长类动物中,包括常见的马莫塞特猴子和人类7,11,13。,137,此外,脑膜淋巴血管不限于头骨,而是延伸到椎柱内到脊髓神经和拉米13,18,的表面。椎柱淋巴的三维(3D)成像,保留了标记的椎骨和脊柱样本的整体解剖,包括上部骨骼,肌肉,韧带,以及邻近的内脏组织,最近进行了14。iDISCO+ 协议 19,20用于免疫贴分分,清除整个椎柱的制剂与淋巴特异性抗体对膜受体 LYVE121 或转录因子 PROX122。然后使用光片荧光显微镜 (LSFM) 和 Imaris 软件进行图像采集和分析。LSFM允许通过照明的轴向限制对大型试样进行快速和微创的3D成像,从而减少光漂白和光毒性23。
iDISCO+/LSFM 方法允许对硬膜和硬膜外淋巴血管的不同层进行表征,以及此血管与椎外淋巴回路和椎柱相邻的 LNs 的连接。该协议适用于以前注射荧光示踪剂的组织,以证明椎道排水。本文详细介绍了 iDISCO+/LSFM 成像椎骨淋巴血管的方法,并说明了其与 CSF 和硬膜外流体排水研究的相关性。
iDISCO+/LSFM 协议在细胞分辨率水平上提供其周围组织内 CNS 相关淋巴网络前所未有的 3D 视图。由于LSFM光学系统的局限性、工作距离的缩短以及高分辨率显微镜23商用物镜的较大尺寸,本协议很好地适应了中等尺寸的样品,而不是1.5厘米3。这种限制阻止捕获整个大脑相关的淋巴系统。需要注意的是,调查区域必须谨慎划定,必须仔细解剖中枢和周围组织,以便包括有助于整个淋巴电路的颅外淋巴血管和LN(表2)。
除了大小和解剖考虑外,周围间质组织的复杂性沿头骨和椎柱变化,这需要适应脱钙和预清治疗,以获得均匀的样本澄清,并允许光束在软等向异性生物组织内传播。在没有骨骼的情况下,大脑或脊髓组织的LFSM成像不需要脱钙步骤,所捕获图像的最终分辨率是最佳的19。上述协议,包括与莫尔斯溶液的轻度脱钙步骤,已很好地适应椎柱的LSFM成像,如图1和图4所示。相比之下,颈部区域显示一个特别复杂的骨骼解剖,除了多层肌肉、脂肪和腺体组织,这降低了捕获的LSFM图像的质量,如图3B所示。因此,通过更严格的组织治疗,可以改善颈部和颈椎区域的LSFM成像;例如,与 EDTA,如前面报告24。因此,脱钙步骤至关重要,在开始完整的 iDISCO ® 协议之前,必须先对使用的每个抗体进行脱钙条件测试(表2) 。
虽然 iDISCO=/LSFM 协议允许生成连接门膜和硬膜外空间和相关 LNs 之间的电路的 3D 视图, LSFM捕获的图像对淋巴血管的直接定量分析不可行,原因如下:1)由于淋巴标记表达的不连续模式,淋巴血管电路的划定不可靠,因为膜脑膜LYVE1是异源分布的21,PROX1具有核表达模式22;2) 抗体的异质渗透,以及由于不完全和异质脱钙和预清除而可能持续在生物组织中的各向异性。因此,LSFM成像需要通过虚拟现实工具进行扩展,这些工具可实现交互式可视化,从而促进淋巴血管(www.syglass.io)。值得注意的是,CNS相关电路的精确描述需要备份LSFM信息与通过传统免疫标记获得的高分辨率共生数据在薄(5~10μm)低温(5~10μm)低温或石蜡嵌入组织部分,特别是精确定位淋巴血管的位置与杜拉母体和CSF,如前面报道的11,14,18。,14,18
iDISCO=/LSFM 协议允许对 CNS 相关淋巴系统中的大分子排水进行三维可视化,如图3 和图4 所示。然而,淋巴排水功能评估要求,除了上面详细说明的 iDISCO+/LSFM 协议的建议外,还需要遵循严格的程序,因为最终结果取决于注射手术的质量、分娩地点的选择、使用的大分子标记的类型和注射量,以及追踪器管理后牺牲的时间(表2)。. 由于注射动物之间的示踪模式的变化,淋巴排水回路的表征需要大型实验组(按注射条件计算>10)。在提出的协议中,1) 注射前必须刺穿杜拉母体,以防止不必要的病变和渗透到中枢母体组织中;2) 注射体积必须小于2μL,以限制不必要的扩散通过注射孔,沿注射毛细管,进入硬膜外空间或椎外组织;3) 注射毛细管插入的深度必须限制在杜拉母体以下 2 mm 以下,以避免在 ICM 和中芯注射中分别出现 CNS 伤害或目标错误。另请注意,如上所示,需要对邻近的椎段进行补充性高分辨率共合分析,以评估淋巴血管内是否存在注射的示踪剂。此分析需要建立标记标记淋巴血管横截面的示踪图和淋巴标记的强度剖面图。这种方法以前用于证明 OVA555在注射后 15 分钟内被 ThLb 淋巴细胞吸收(Jacob 等人中的辅助图 5F)。14然而,本研究中尚未说明抗LYVE1示踪剂(图4)。
在可能的CSF示踪剂中,OVA-A555是一个很好的选择,因为它耐受 iDISCO®协议处理,并保持 LSFM 成像的高荧光。但是,请注意,跟踪器的类型必须根据分析时间点(表1 和表2)选择。如上所述,注射14后15分钟观察到局部椎间淋巴血管的OVA-A555标签。然而,与抗LYVE1抗体(图4 )相比,这些局部淋巴回路中不再检测到OVA-A 555(图3)。555
总之,iDISCO+/LSFM协议非常适用于研究中枢神经系统在生理和病理条件下的三D结构和排水,如中枢神经系统和椎柱癌,或椎骨和关节疾病。虽然整个程序很长,需要方法严谨,但它在使用虚拟现实工具和高分辨率共声成像进行互补分析时提供了有价值且独特的信息。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家医学研究所的支持, 国家 Recherche (ANR-17-CE14-0005-03),Cerveau(FRC 2017),卡诺特成熟(至L.J.),里约热内卢联邦大学(UFRJ代表J.B.)、NIH(R01EB016629-01)和耶鲁医学院。我们承认ICM平台:用于细胞成像的ICM-QUANT和用于免疫组织化学的ICM-HISics。所有动物工作都在PHENO-ICMice设施进行。核心得到2个”投资”(ANR-10-IAIHU-06和NR-11-INBS-0011-NeurATRIS)和”梅迪卡莱基金会”的支持。我们感谢尼古拉斯·雷尼尔的方法论建议和手稿阅读。
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |