Un protocole est présenté combinant la compensation de tissu avec la microscopie de fluorescence de feuille de lumière (LSFM) pour obtenir des images tridimensionnelles et de résolution cellulaire des vaisseaux lymphatiques et des ganglions lymphatiques (LNs) recueillant le fluide céphalo-rachidien (CSF) et le fluide épidural spinal.
Le système lymphatique associé au système nerveux central (SNC) comprend la vascularisation lymphatique qui tourne autour du cerveau, de la moelle épinière et de ses LN associés. Le système lymphatique associé au SNC est impliqué dans le drainage des macromolécules CSF et des cellules immunitaires méningées vers les LN drainant le SNC, régulant ainsi le déblaiement des déchets et la surveillance immunitaire dans les tissus du SNC. Présenté est une nouvelle approche pour obtenir des images tridimensionnelles (3D) et de résolution cellulaire des lymphatiques associés au SNC tout en préservant l’intégrité de leurs circuits dans les tissus environnants. Le protocole iDISCO+ est utilisé pour immunolabelr les vaisseaux lymphatiques dans les préparations de montage entier décalcifiés et dégagés de la colonne vertébrale qui sont ensuite photographiés avec la microscopie de fluorescence de feuille de lumière (LSFM). La technique révèle la structure 3D du réseau lymphatique reliant les espaces méningéal et épidural autour de la moelle épinière aux vaisseaux lymphatiques extravertébraux. Les images 3D des circuits de drainage des traceurs moléculaires précédemment injectés dans le CSF par l’intermédiaire de la cisterna magna ou du parenchyme spinal thoracoumbar. L’approche iDISCO+/LSFM offre des occasions sans précédent d’explorer la structure et la fonction du système lymphatique associé au SNC en biologie neurovasculaire, neuroimmunologie, cancer du cerveau et des vertèbres, ou biologie vertébrale des os et des articulations.
Le SNC est entouré par le CSF et superposant des couches de méninges, de tissu épidural et d’os. Au total, le CSF offre une protection physique au cerveau doux et à la moelle épinière. Il est principalement sécrété par le plexus choroïde et les membranes méningéales (c.-à-d. le pia mater, l’arachnoïde et le dura mater). Le complexe CSF-méningéal établit également une interface fonctionnelle entre les tissus du SNC et le reste du corps, contribuant ainsi à l’homéostasie du SNC. Tout d’abord, le CSF pénètre le parenchyme du SNC à travers les espaces paraériels du SNC et interagit dynamiquement avec le fluide interstitiel (ISF)1 via le système glymphatique (glia-lymphatique), qui se compose des espaces paravasculaires et des membranes des pieds d’extrémité astrocytes autour des vaisseaux CNS2,3,4. Les déchets métaboliques et l’excès de liquide sont ensuite finalement effacés par drainage périvasculaire intra-muros directement du parenchyme cérébral vers la circulation systémique3, ainsi que les espaces paraventous vers le CSF et par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques drainant le cerveau, selon le modèle glympmatique2,4. L’écoulement du CSF se fait principalement par l’intermédiaire du système lymphatique, à travers la plaque cribriforme et les vaisseaux lymphatiques extracrâniens associés5,,6,7, ainsi que par les vaisseaux lymphatiques méningés, qui convergent aux LN8,,9,10,11,12 ( Figure1). Un rôle important, bien que secondaire, dans la sortie de CSF est pris par les villi arachnoïdes crâniens, qui pénètrent la lacune des sinus veineux méningés13.
Les circuits de drainage du SCF ont fait l’objet d’une étude approfondie au moyen d’approches expérimentales basées sur l’injection de traceurs colorés/fluorescents dans le SNC ou le CSF, suivis de l’imagerie du modèle des traceurs à l’intérieur du SNC et dans l’ensemble des organes et tissus du corps à différents points de temps après l’injection13. Pendant longtemps, l’écoulement du CSF a été considéré comme exclusivement et directement pris en charge par la circulation sanguine, par le biais de villoïdes arachnoïdes se projetant dans les sinus veineux dural13. Cependant, l’écoulement de CSF est principalement exécuté par la vascularisation lymphatique, comme récemment montré par l’imagerie dynamique proche-infrarouge (NIR) du transport de traceur CSF-injecté chez les souris9,10. Les vaisseaux lymphatiques drainants par CSF retournent alors la lymphe dans la circulation sanguine par l’intermédiaire de la veine subclavian droite. Des approches complémentaires ont détecté à la fois des sorties extracrâniennes6,,7,,13 et intracrâniennes9,10,11,12 sorties lymphatiques des traceurs injectés CSF et suggèrent que le CSF soit absorbé par deux voies lymphatiques, l’une externe et l’autre interne au crâne et à la colonne vertébrale. La partie principale du drainage CSF se produit rapidement par les vaisseaux lymphatiques situés rostrally, à l’extérieur du crâne dans la muqueuse nasale, par les canaux de la plaque critriforme de l’os éthmoid3,6,13 et, caudally, en dehors des os vertébraux lumbosacral par des voies dorsolaterales qui ne sont pas encore entièrementcaractérisés 7,14. En outre, dans les méninges du crâne, les capillaires lymphatiques de la dura mater absorbent directement CSF et les cellules immunitaires meningales vers les collecteurs lymphatiques dural qui traversent les os du crâne et se connectent aux LNs12,,14. Ces vaisseaux lymphatiques méningés jouent un rôle important dans la pathophysiologie du SNC, parce que les lymphatiques méningés du cerveau sont altérés lors du vieillissement et ont également un impact sur les résultats des maladies neurologiques du cerveau, y compris la neurodégénérescence, la neuroinflammation, et le cancer du cerveau15,16,17. Par conséquent, la vascularisation lymphatique associée au SNC (c.-à-d. les vaisseaux lymphatiques durals et périphériques drainant le CSF) peut être une nouvelle cible prometteuse pour combattre les maladies du SNC chez l’homme.
Des études convergentes réalisées avec l’immunohistologie et l’imagerie par résonance magnétique à haute résolution ont démontré que la vascularisation lymphatique méningée existe également chez les primates, y compris les singes marmoset communs et les humains7,11,13. En outre, les vaisseaux lymphatiques méningés ne sont pas limités au crâne, mais s’étendent dans la colonne vertébrale à la surface des ganglions spinaux et rami13,18. L’imagerie tridimensionnelle (3D) des lymphatiques de colonne vertébrale préservant l’anatomie globale des échantillons vertébraux et spinaux étiquetés, y compris les os, les muscles, les ligaments, ainsi que les tissus viscéraux voisins, a été récemment effectuée14. L’iDISCO+ protocole19,20 a été utilisé pour immunolabel décalcifié et autorisé les préparations de toute la colonne vertébrale avec des anticorps lymphatiques spécifiques contre le récepteur de la membrane LYVE121 ou le facteur de transcription PROX122. L’acquisition et l’analyse d’images ont ensuite été réalisées avec la microscopie de fluorescence des feuilles de lumière (LSFM) et le logiciel Imaris. LSFM permet une imagerie 3D rapide et peu invasive de grands spécimens par confinement axial de l’éclairage, ce qui entraîne une réduction du photobleachage et de la phototoxicité23.
L’approche iDISCO+/LSFM permet la caractérisation des couches distinctes des vaisseaux lymphatiques durals et épidurales, et la connexion de cette vasculature aux circuits lymphatiques extravertébraux et aux LN voisins de la colonne vertébrale. Le protocole a été appliqué aux tissus précédemment injectés avec des traceurs fluorescents pour démontrer le drainage vertébral de canal. Le présent document fournit des détails sur la méthodologie iDISCO+/LSFM pour l’image de la vascularature lymphatique vertébrale et illustre sa pertinence pour csf et l’étude de drainage de fluide épidural.
Le protocole iDISCO+/LSFM fournit des vues 3D sans précédent du réseau lymphatique associé au SNC dans ses tissus environnants à un niveau de résolution cellulaire. Ce protocole est bien adapté aux échantillons de taille moyenne, et non à 1,5 cm3, en raison des limites du système optique LSFM, de la distance de travail réduite et de la grande taille des lentilles objectives commerciales pour la microscopie haute résolution23. Cette limitation empêche la capture de l’ensemble du système lymphatique associé au cerveau. Il est important de noter que le domaine d’investigation doit être délimité avec prudence et que les tissus entourant le SNC doivent être soigneusement disséqués afin d’inclure les vaisseaux lymphatiques extracrâniens et les LN qui contribuent à l’ensemble des circuits lymphatiques (tableau 2).
En plus de la taille et des considérations anatomiques, la complexité des tissus mésenchymal environnants varie le long du crâne et de la colonne vertébrale, ce qui nécessite l’adaptation de la décalcification et du traitement précombrant afin d’obtenir une clarification homogène de l’échantillon et de permettre la propagation du faisceau lumineux dans un tissu biologique isotrope mou. En l’absence d’os, l’imagerie LFSM du cerveau ou des tissus de la moelle épinière ne nécessite pas l’étape de décalcification, et la résolution finale des images capturées est optimale19. Le protocole décrit ci-dessus, qui comprend une étape de décalcification légère avec la solution de Morse, est bien adapté pour l’imagerie LSFM de la colonne vertébrale comme illustré dans la figure 1 et la figure 4. En revanche, la région du cou affiche une anatomie osseuse particulièrement complexe en plus de plusieurs couches de muscles, de graisses et de tissus glandulaires, qui réduisent la qualité des images capturées de LSFM, telles que reflétées dans la figure 3B. L’imagerie LSFM du cou et de la région cervicale peut donc être améliorée par un traitement plus rigoureux des tissus; par exemple, avec EDTA, comme indiqué précédemment24. L’étape de décalcification est donc critique et les conditions de décalcification doivent être testées précédemment pour chaque anticorps utilisé avant de commencer le protocole iDISCO+ complet (tableau 2).
Alors que le protocole iDISCO+/LSFM permet la génération d’une vue 3D de la connexion des circuits entre les espaces méningés et épidurales et les LN associés, l’analyse quantitative directe de la vascularisation lymphatique à partir d’images capturées par le LSFM n’est pas possible pour les raisons suivantes : 1) la délimitation des circuits lymphatiques des vaisseaux n’est pas fiable en raison du modèle discontinu de l’expression des marqueurs lymphatiques, parce que le LYVE1 membranenaire est distribué de façon hérétique21 et PROX1 a un modèle d’expression nucléaire22; 2) la pénétration hétérogène des anticorps, ainsi que l’anisotropie qui peut persister dans le tissu biologique en raison de la décalcification incomplète et hétérogène et le précontrôle. L’imagerie LSFM doit donc être étendue par des outils de réalité virtuelle qui permettent une visualisation interactive et facilitent ainsi la quantification de la vascularisation lymphatique (www.syglass.io). Il convient également de noter que la description précise des circuits associés au SNC nécessite la sauvegarde de l’information LSFM avec des données confocales à haute résolution obtenues par immunoétiquement conventionnel sur des sections de cryostat ou de tissus incorporés à la paraffine, en particulier pour localiser précisément la position des vaisseaux lymphatiques en ce qui concerne le dura mater et le CSF, comme indiqué précédemment11,14,18.
Le protocole iDISCO+/LSFM permet la visualisation tridimensionnelle du drainage macromoléculaire dans le système lymphatique associé au SNC, comme l’illustre la figure 3 et la figure 4. Toutefois, l’évaluation fonctionnelle du drainage lymphatique exige, en plus des recommandations sur le protocole iDISCO+/LSFM détaillée ci-dessus, suivant une procédure rigoureuse, car le résultat final dépend de la qualité de la chirurgie d’injection, du choix du site d’accouchement, du type et du volume injecté de marqueur macromolécule utilisé, et du temps de sacrifice après l’administration du traceur (Tableau 2). En raison des variations du modèle de traceur entre les animaux injectés, la caractérisation des circuits de drainage lymphatique nécessite de grands groupes expérimentaux (>10 par condition d’injection). Dans le protocole présenté, 1) le dura mater doit être perforé avant l’injection pour empêcher les lésions indésirables et la pénétration dans les tissus du SNC; 2) le volume injecté doit être inférieur à 2 μL pour limiter la diffusion non désirée par le trou d’injection, le long du capillaire d’injection, dans l’espace épidural ou les tissus extravertébraux; 3) la profondeur de l’insertion capillaire par injection doit être limitée à 2 mm en dessous de la dura mater pour éviter les blessures du SNC ou le brouillard dans les injections icm et intraspinal, respectivement. Notez également qu’une analyse confocale complémentaire à haute résolution des segments vertébraux voisins doit être effectuée, comme indiqué ci-dessus, pour évaluer la présence de traceur injecté à l’intérieur des vaisseaux lymphatiques. Cette analyse nécessite d’établir les parcelles de profil d’intensité du traceur et du marqueur lymphatique sur des sections transversales des vaisseaux lymphatiques marqués par marqueur. Cette approche a déjà été utilisée pour démontrer l’absorption d’OVA555 par les lymphatiques ThLb à 15 min après injection (Figure supplémentaire 5F dans Jacob et al.14). Toutefois, il n’a pas été illustré pour le traceur anti-LYVE1 dans la présente étude (Figure 4).
Parmi les traceurs CSF possibles, OVA-A555 est une excellente option car il est résistant aux traitements de protocole iDISCO+ et maintient une fluorescence élevée pour l’imagerie LSFM. Toutefois, notez que le type de traceur doit être choisi conformément au point de tempsd’analyse ( tableau 1 et tableau 2). Comme indiqué ci-dessus, l’étiquetage OVA-A555 des vaisseaux lymphatiques vertébraux locaux est observé à 15 min après l’injection14. Cependant, OVA-A555 n’est plus détecté dans ces circuits lymphatiques locaux à 45 min après injection (figure 3) contrairement à l’anticorps anti-LYVE1 (figure 4).
Pour conclure, le protocole iDISCO+/LSFM est bien adapté pour étudier la structure 3D et le drainage du système lymphatique associé au SNC dans des conditions physiologiques et pathologiques telles que les cancers du SNC et de la colonne vertébrale, ou les maladies vertébrales des os et des articulations. Bien que la procédure complète soit longue et exige une rigueur méthodologique, elle fournit des informations précieuses et uniques lorsqu’elle est utilisée avec une analyse complémentaire à l’aide d’outils de réalité virtuelle et d’imagerie confocale haute résolution.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l’Institut national de la Sante et de la Recherche Médicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (à L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ pour J.B.), NIH (R01EB016629-01) et Yale School of Medicine. Nous reconnaissons les plates-formes ICM : ICM-QUANT pour l’imagerie cellulaire et ICM-histomics pour l’immunohistochimie. Tous les travaux sur les animaux ont été effectués à l’installation PHENO-ICMice. Le Noyau est soutenu par 2 « Investissements d’avenir » (ANR-10- IAIHU-06 et ANR-11-INBS-0011-NeuraTRIS) et la « Fondation pour la Recherche Médicale ». Nous reconnaissons Nicolas Renier pour ses conseils méthodologiques et sa lecture manuscrite.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |