Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung, Reinigung und Quantifizierung von Caenorhabditis elegans extrazellulären Vesikeln vor.
Die Sekretion kleiner membrangebundener Vesikel in die äußere Umgebung ist ein grundlegender physiologischer Prozess aller Zellen. Diese extrazellulären Vesikel (EVs) funktionieren außerhalb der Zelle, um globale physiologische Prozesse zu regulieren, indem sie Proteine, Nukleinsäuren, Metaboliten und Lipide zwischen Geweben übertragen. Elektrofahrzeuge spiegeln den physiologischen Zustand ihrer Ursprungszellen wider. Elektrofahrzeuge sind damit verpflichtet, in praktisch jedem Aspekt der menschlichen Gesundheit eine grundlegende Rolle zu spielen. So werden EV-Protein eis- und genetische Ladungen zunehmend auf Biomarker von Gesundheit und Krankheit analysiert. Dem EV-Bereich fehlt jedoch noch ein transportables Wirbellosenmodellsystem, das die Untersuchung der Zusammensetzung der EV-Ladung ermöglicht. C. elegans eignet sich gut für die EV-Forschung, da es Elektrofahrzeuge außerhalb seines Körpers aktiv in seine äußere Umgebung absondert, was eine einfache Isolation ermöglicht. Dieser Artikel enthält alle notwendigen Informationen zum Generieren, Reinigen und Quantifizieren dieser ökologisch abgesonderten C. elegans EVs, einschließlich der quantitativen Arbeit mit sehr großen Populationen alterssynchronisierter Würmer, reinigender Elektrofahrzeuge und eines Flow-Zytometrie-Protokolls, das direkt die Anzahl intakter Elektrofahrzeuge in der gereinigten Probe misst. So kann die große Bibliothek genetischer Reagenzien, die für die C. elegans-Forschung zur Verfügung stehen, für die Untersuchung der Auswirkungen genetischer Pfade und physiologischer Prozesse auf die Zusammensetzung von EV-Ladungen erschlossen werden.
Die Sekretion von membrangebundenen extrazellulären Vesikeln (EVs) erleichtert die globalen physiologischen Prozesse, indem bestimmte Protein-, Nukleinsäure-, Metaboliten- und Lipidladungen aktiv zwischen den Zellen1transportiert werden. Zellen sezernieren Elektrofahrzeuge, die ein Kontinuum von Größen von 2 m oder größer bis zu 20nm2umfassen. Kleine Elektrofahrzeuge (<200 nm) werden zunehmend untersucht, weil sie sich auf pathologische Prozesse, einschließlich Stoffwechselstörungen, Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen3,4,5. Diese Pathologien haben auch gezeigt, dass die Protein-und genetische Zusammensetzung der EVs Ladungen von kleinen Elektrofahrzeugen beeinflussen. Daher werden Biomarkersignaturen der Pathologie zunehmend durch EV-Frachtermittlungsmethoden wie LC-MS-MS und RNAseq6,7,8,9aufgedeckt.
C. elegans war ein nützliches wirbelloses Modell zur Identifizierung evolutionär konservierter EV-Signalwege. Zum Beispiel wurde eine C. elegans flippase zuerst gezeigt, um die EV-Biogenese in C. elegans Embryonen zu induzieren, und der menschliche Homolog wurde gezeigt, dass er die Freisetzung von EV in menschlichen Zellenbeeinflusst 10,11. C. elegans EVs wurden berichtet, Igel-Signale zu tragen, die für die Entwicklung von Cuticle notwendig sind. Die Lieferung von Igel und andere Morphogene wurde gezeigt, dass eine wichtige Entwicklungsrolle von Elektrofahrzeugen zu spielen, und es ist in Zebrafischen, Mäusen und Menschenkonserviert 12,13,14,15. C. elegans eignet sich gut für die Entdeckung von EV-Biomarkern, da es Elektrofahrzeuge außerhalb seines Körpers absondert, die in der Kommunikation von Mensch zu Tier funktionieren16,17 (Abbildung 1A). Die in einer früheren Studie eingeführte Methodik kann jedoch nicht angewandt werden, da die E. coli-Lebensmittelquelle der Nematoden auch EVs18absondert. Bei dieser Methode besteht der größte Teil der Probe aus E. coli-Kontamination, die die Leistung von proteomischen oder RNAseq-Ansätzen für die Entdeckung von C. elegans EV-Ladungen begrenzt. Die hier beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um hochreine C. elegans EVs auf Überflussniveaus zu ergeben, die für typische Zellkulturexperimente charakteristisch sind, und so omics Ansätze für die EV-Biomarker-Entdeckung zu erleichtern.
Große Populationen von Würmern werden benötigt, um eine ausreichende Anzahl von Elektrofahrzeugen für die Frachtanalyse zu generieren. Daher sind auch Methoden zur quantitativen Kultivierung großer Populationen entwicklungssynchronisierter C. elegans enthalten. Wenn eine große Anzahl von Würmern für Experimente benötigt wird, werden sie in flüssigen Medien kultiviert. Während dies wirksam ist, um große Populationen von Würmern zu erzeugen, unterscheidet sich die Physiologie der Tiere erheblich von Würmern, die unter Standardbedingungen auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Agarplatten angebaut werden. Tiere, die in Flüssigkeit kultiviert werden, wachsen langsamer, sind dünner, zeigen entwicklungsfördernde Heterogenität und sind einem hohen Maß an Batchvariabilität ausgesetzt. Daher präsentieren wir ein einfaches, aber effektives Mittel für die quantitative Kultivierung großer Populationen entwicklungssynchronisierter C. elegans mit 10 cm hohen Wachstumsplatten. Die Medienzusammensetzung von Hochwachstumsplatten enthält mehr Pepton als normale NGM-Platten und wird mit dem E. coli-Stamm NA22 gesät, der robuster wächst als OP50.
Fortschritte in der Durchflusszytometrietechnologie (FACS) haben die direkte Analyse einzelner Elektrofahrzeuge20,21ermöglicht, um die Quantifizierung von Elektrofahrzeugen ohne die inhärenten Einschränkungen anderer Methoden zu ermöglichen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Protein kein nützlicher Proxy für die EV-Fülle ist, da unterschiedliche Reinigungsmethoden zu deutlich unterschiedlichen EV-Protein-Verhältnissen führen22. Extrem reine EV-Fraktionen enthalten relativ wenig Protein, was es schwierig macht, Proben mit BCA- oder Coomassie-Gelen zu quantifizieren. Westliche Analysen können relative Unterschiede einzelner Proteine identifizieren, aber nicht identifizieren, wie viele Elektrofahrzeuge sich in der Stichprobe befinden. Die robuste Quantifizierung der EV-Zahl durch Nanopartikel-Tracking-Analyse wird durch ihren engen Signal-Rausch-Bereich, die Unfähigkeit, zwischen Elektrofahrzeugen und festen Aggregaten zu unterscheiden, und die mangelnde Übertragbarkeit von Methoden zwischen Instrumenten mit unterschiedlichen Spezifikationen behindert23. Daher enthält dieser Artikel auch ein verallgemeinerbares zytometrisches Verfahren zur Unterscheidung und Quantifizierung von Elektrofahrzeugen.
Eine grundlegende Herausforderung des EV-Bereichs ist die Trennung der Vielfalt der EV-Subtypen2. Die hier beschriebenen Methoden verwenden Filtration, Differentialzentrifugation und Größenausschlusschromatographie, um eine reine Population kleiner Elektrofahrzeuge zu erzeugen, da zuvor gezeigt wurde, dass 100 nm Elektrofahrzeuge in die äußere Umgebung abgesondert wurden und in physiologisch relevanten Kommunikationswegen funktionieren16. EVs, die durch Größenausschlusschromatographie gereinigt werden, können immer noch eine Mischung aus Exosomen und kleinen Mikrovesikeln sein, da diese EV-Unterklassen ähnlich dimensioniert sind. Wirbeltier-EV-Unterklassen werden häufig durch Immunpräzipitation getrennt, da diese Methode Elektrofahrzeuge durch Bindung an selektive Membranproteinmarker isoliert. Die beschriebenen Methoden erleichtern die Identifizierung von C. elegans EV Membranmarkerproteinen. Daher könnte es in Zukunft möglich sein, kleine EV-Unterklassen durch analoge Immunpräzipitierungsmethoden weiter zu trennen. Theoretisch könnte Die Immunpräzipitation EVs von gut gefütterten Würmern isolieren, da E. coli EVs nicht mit dem Antikörper interagieren sollten. Forscher, die daran interessiert sind, die Protein- und gengenetischen Ladungen größerer EV-Unterklassen (>200 nm) zu identifizieren, können dies tun, indem sie den Filterschritt von 0,22 m überspringen und dann das Pellet anstelle des Überstandes analysieren. Die Aufdeckung der Protein- und genetischen Ladungsmengen großer Elektrofahrzeuge wird ein umfassenderes Verständnis der physiologischen Prozesse schaffen, die durch das C. elegans-Sekrelom funktionieren. C. elegans EVs werden nicht nur in die Umwelt abgesondert, sondern auch intern zwischen Geweben übertragen. Daher isolieren diese Methoden nur eine Teilmenge der gesamten C. elegans EVs. Die Ladungsentdeckung interner Elektrofahrzeuge ist jedoch nicht möglich, da es keine Methode gibt, Um Elektrofahrzeuge von lysierten Würmern zu trennen. Die Frachtanalyse dieser extern abgesonderten EV-Teilmenge bietet eine Möglichkeit, potenzielle allgemeine EV-Proteinmarker zu identifizieren, die auch interne Elektrofahrzeuge kennzeichnen können.
Der Umfang der EV-Vorbereitung hängt von den Anforderungen des Experiments ab. Insgesamt 500.000 junge Erwachsene bieten genügend Elektrofahrzeuge für die parallele Durchführung von Durchflusszytometrie, LC-MS-MS und RNAseq-Analyse. Diese Zahl kann je nach experimentellem Bedarf nach oben oder unten skaliert werden. Der größte praktische Faktor für die Skalierung ist die Anzahl der benötigten 10 cm hohen Wachstumsplatten. Hochwachstumsplatten, die mit 500 L 20x konzentrierter NA22-Kultur über Nacht hergestellt werden, werden eine Bevölkerung von 50.000 Erwachsenen vom L1-Larvenstadium bis zum ersten Tag des Erwachsenenalters unterstützen. Um ein Experiment mit 500.000 Erwachsenen durchführen zu können, werden daher 13 Hochwachstumsplatten benötigt: eine Platte, um die Population von L1s zu erzeugen, zwei Platten, um die Erwachsenen zum Bleichen zu erzeugen, und 10 Platten für das Wachstum der Versuchstiere. Diese Metriken sind abhängig von den Saat- und Bakterienwachstumsbedingungen der hohen Wachstumsplatten. Daher wird empfohlen, alle Platten in standardisierter Weise herzustellen und dann mit bekannten Mengen von Tieren zu kalibrieren.
Würmer werden während des Kultivierungsprozesses in zwei Stufen gezählt: 1) vor der Aussaat von Würmern auf Tellern und 2) vor der Erzeugung der konditionierten Medien. Die Anbaudichte von Tieren hat gezeigt, dass sie das Verhalten, die Entwicklung und die Stressreaktionen15,16,17,18 beeinflusst und daher auch EV-Ladungen beeinflussen kann. Für eine gleichbleibende Anbaudichte ist es daher notwendig, die Wurmpopulationen genau abzuschätzen. Die Quantifizierung der Anzahl der Würmer in neun Tropfen gibt statistisches Vertrauen der Bevölkerungsschätzungen. Es ist wichtig, jeden Tropfen einzeln zu behandeln, zwischen jedem Tropfen zu wirbeln und die Pipette in der gleichen Entfernung in die Wurmsuspension einzufügen. Durch diese Vorsichtsmaßnahmen werden S.E.M.-Werte von 5–10 % der Gesamtbevölkerung sichergestellt. Wenn die S.E.M. für eine Wurmpopulation höher als 20% ist, dann ging etwas schief.
Nach der 24 h bakteriellen Inkubationszeit kriechen junge, wilde Typ C. Elegans sofort nach Zugabe zu einem bakteriellen Rasen. Dies deutet darauf hin, dass die Inkubation ihre Gesundheit nicht ernsthaft beeinträchtigt. Dieser Schritt beeinflusst jedoch die Physiologie der Tiere und kann daher die Zusammensetzung der EV-Ladungen beeinflussen. Daher ist es bei der Arbeit mit sehr kranken Genotypen oder älteren Tieren wichtig, die Lebensfähigkeit nach dem Inkubationsschritt zu überprüfen. Wenn alle Tiere die Inkubation nicht überleben, erhöhen Sie die experimentelle Populationsgröße und verringern Sie die Zeit der Inkubation. Bei der Arbeit mit großen Mengen konditionierter Medien ist es praktischer, einen Rührzellenkonzentrator mit einem Filter aus regenerierter Nitrocellulose zu verwenden. Elektrofahrzeuge binden diese Filterchemie nicht so stark wie andere Filtertypen14.
Das Verhältnis des gesamten Proteins, das aus den konditionierten Medien gewonnen wird, zur Anzahl der Tiere, die zur Herstellung der Zubereitung inkubiert werden, ist eine nützliche Metrik. Wenn dieses Verhältnis viel höher ist als erwartet, dann ist es möglich, dass die Populationsschätzungen ausfielen oder dass Tiere in den konditionierten Medien verendeten und sich verschlechterten. Wenn dieses Verhältnis viel niedriger als erwartet ist, dann kann ein Protein auf den Filtern während des Konzentrationsprozesses verloren gegangen sein. Während die FACS-Methoden die EVs in der Vorbereitung direkt quantifizieren, ist diese Metrik nützlich, da sie Stichprobenanomalien zu einem frühen Beginn des Prozesses hervorheben kann. Eine weitere nützliche Methode zur Überprüfung der Qualität der EV-Präparation ist die Transmissionselektronenmikroskopie, wie in Abbildung 4Ddargestellt. Obwohl das Protokoll für die Transmissionselektronenmikroskopie aufgrund der Länge formal nicht in diesem Methodenartikel enthalten ist, kann es mit Standardmethoden durchgeführt werden. Es wird empfohlen, diese Art der Analyse zumindest anfangs als ergänzende Methode für FACS zur Beurteilung der Qualität von EV-Präparaten durchzuführen. Für beste Ergebnisse verwenden Sie frisch entladene Formvar-Kohlenstoff-Gitter und färben Sie die Proben mit 2% Phosphotungssäure anstelle von Uranylacetat.
DI-8-ANEPPS wurde ausgewählt, weil es nachweislich EV-Membranen quantitativ kennzeichnen deuziert und andere allgemeine EV-Farbstoffe mit humanen Biopsieproben und Liposomen25übertrifft. Die Messungen sind schnell und nehmen nur 3 min Sammelzeit für jede Probe. Die Quantifizierung waschmittelempfindlicher Elektrofahrzeuge hat eine direkte funktionelle Bedeutung, da sie von einer grundlegenden physikalischen Unterscheidung zwischen Elektrofahrzeugen und festen Lipoproteinaggregaten profitiert. Wichtig ist, dass diese Methode nicht durch die Menge an Gesamtprotein oder die Anzahl der Nicht-EV-Aggregate beeinflusst wird und daher Elektrofahrzeuge, die durch verschiedene Reinigungsmethoden gewonnen werden, unvoreingenommen quantifizieren kann. Die FACS-verifizierte EV-Metrik, die wir hier beschreiben, wäre besonders hilfreich für Studien, die physiologische Auswirkungen gereinigter Elektrofahrzeuge nachweisen. Es könnte auch dem EV-Bereich im Allgemeinen zugute kommen, eine FACS-Methodik als universelle Metrik zu etablieren, damit absolute EV-Überflussmengen direkt über Studien hinweg verglichen werden können. Vitalfarbstoffe können auch C. elegans EVs kennzeichnen, aber sie sind nicht so hell wie Elektrofahrzeuge, die mit Di-8-ANEPPS beschriftet sind.
Dieser Reinigungsansatz profitiert von der aktiven Sekretion von Elektrofahrzeugen außerhalb der Körper intakter, lebender Würmer. Dies ermöglicht es C. elegans EVs, in vergleichbarer Reinheit und Fülle wie aus der Zellkultur isoliert zu werden, Spezifikationen, die ausreichen, um Hunderte von Protein- und RNA-Ladungen über LC-MS-MS und RNAseq-Analyse26zu identifizieren. So kann die große Bibliothek von Reagenzien, die für die C. elegans Forschung zur Verfügung stehen, genutzt werden, um den Einfluss der genetischen und physiologischen Störung auf die Zusammensetzung der EV-Ladung zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Nick Terzopoulos für Wurmplatten und Reagenzien; das Caenorhabditis Genetics Center (CGC) am NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) für die Nematodenlinie N2; Lucia Vojtech, PhD, für Unterstützung bei der Nanopartikel-Tracking-Analyse; Jessica Young, PhD, und Marie Claire, MD, PhD, für hiPSC-abgeleitete neuronale konditionierte Zellmedien; Wai Pang für Unterstützung bei der TEM-Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss P30AG013280 an MK und den NIH-Zuschuss AG054098 an JCR unterstützt.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |