تعرض هذه المقالة أساليب لتوليد وتنقية وقياس الحويصلات Caenorhabditis elegans خارج الخلية.
إفراز الحويصلات الصغيرة المرتبطة بالغشاء في البيئة الخارجية هو عملية فسيولوجية أساسية لجميع الخلايا. تعمل هذه الحويصلات خارج الخلية (EVs) خارج الخلية لتنظيم العمليات الفسيولوجية العالمية عن طريق نقل البروتينات والأحماض النووية والأيض والدهون بين الأنسجة. تعكس المركبات الإلكترونية الحالة الفسيولوجية لخلايا المنشأ الخاصة بها. والمركبات الكهربائية متورطة في أن لها أدواراً أساسية في كل جانب من جوانب صحة الإنسان تقريباً. وهكذا، يتم تحليل بروتين EV والشحنات الوراثية بشكل متزايد للعلامات الحيوية للصحة والمرض. ومع ذلك، لا يزال حقل EV يفتقر إلى نظام نموذج لافقاري قابل للمسار يسمح بدراسة تكوين البضائع EV. C. elegans مناسبة تماما لأبحاث EV لأنه يفرز بنشاط المركبات الكهربائية خارج جسمها في بيئتها الخارجية، مما يسمح العزلة سهلة. توفر هذه المقالة جميع المعلومات اللازمة لتوليد وتنقية وقياس هذه المركبات الكهربائية C. elegans التي تفرزها البيئة بما في ذلك كيفية العمل كميًا مع مجموعات كبيرة جدًا من الديدان المتزامنة مع العمر ، وتنقية المركبات الكهربائية ، وبروتوكول قياس الخلايا التدفقي الذي يقيس مباشرة عدد المركبات الكهربائية السليمة في العينة المنقىة. وهكذا، يمكن استغلال المكتبة الكبيرة من الكواشف الوراثية المتاحة لبحوث C. elegans للتحقيق في آثار المسارات الجينية والعمليات الفسيولوجية على تكوين البضائع EV.
إفراز الحويصلات خارج الخلية المرتبطة بالغشاء (EVs) يسهل العمليات الفسيولوجية العالمية من خلال نقل بروتين معين وحمض نوي ومستقلب وشحنات من الدهون بين الخلايا1بنشاط. تفرز الخلايا EVs التي تمتد سلسلة متصلة من الأحجام تتراوح بين 2 ميكرومتر أو أكبر إلى صغيرة مثل 20 نانومتر2. تتم دراسة المركبات الكهربائية الصغيرة (<200 نانومتر) بشكل متزايد بسبب تأثيرها في العمليات المرضية ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية والسرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية3،4،5. وقد ثبت أيضا هذه الأمراض للتأثير على البروتين والتكوين الوراثي للمركبات الكهربائية الشحنات من المركبات الكهربائية الصغيرة. لذلك ، يتم الكشف بشكل متزايد عن توقيعات العلامات الحيوية للأمراض من خلال طرق اكتشاف البضائع EV مثل LC-MS-MS و RNAseq6و7و8و9.
C. elegans كان نموذجا غير فقاري مفيد لتحديد مسارات إشارات EV المحفوظة بشكل تطوري. على سبيل المثال، تم أول عرض لـ C. elegans flippase للحث على النشأة الحيوية EV في أجنة C. elegans، وأظهر أن التجانس البشري يؤثر على إطلاق EV في الخلايا البشرية10،11. C. elegans EVs تم الإبلاغ عن حمل إشارات القنفذ اللازمة لتطوير cuticle. وقد تبين تسليم القنفذ وغيرها من المورفوجين للعب دور تنموي رئيسي من السيارات الكهربائية، ويتم الحفاظ عليه في حمار وحشي، الفئران، والبشر12،13،14،15. C. elegans هو مناسبة تماما لاكتشاف المؤشرات الحيوية EV لأنه يفرز المركبات الكهربائية خارج جسمها التي تعمل في الاتصالات بين الحيوان والحيوان16،17 (الشكل 1A). ومع ذلك ، لا يمكن استخدام المنهجية التي تم تحديدها من خلال دراسة سابقة لأن مصدر الأغذية E. coli النيماتوديس يفرز أيضًا EVs18. في هذه الطريقة ، تتكون معظم العينة من تلوث الإشريكية القولونية ، مما يحد من قوة نهج البروتيوميات أو RNAseq لاكتشاف شحنات C. elegans EV. تم تطوير الأساليب الموصوفة هنا لإنتاج EVs C. elegans نقية للغاية عند مستويات الوفرة المميزة لتجارب ثقافة الخلايا النموذجية وبالتالي تسهيل نهج omics لاكتشاف المؤشرات الحيوية EV.
وهناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الديدان لتوليد عدد كاف من المركبات الكهربائية لتحليل البضائع. ولذلك، فإن أساليب إجراء الزراعة الكمية لأعداد كبيرة من السكان المتزامنين من الناحية الإنمائية C. elegans مدرجة أيضا. عادة ، عندما تكون هناك حاجة إلى عدد كبير من الديدان للتجارب ، يتم استزراعها في وسائل الإعلام السائلة. في حين أن هذا فعال لتوليد أعداد كبيرة من الديدان ، فإن فسيولوجيا الحيوانات تختلف إلى حد كبير عن الديدان المزروعة في ظل الظروف القياسية على لوحات agar المتوسطة لنمو النيماتودا (NGM). الحيوانات المستزرعة في السائل تنمو ببطء أكبر، وأرق، وتظهر عدم التجانس التنموي، وتخضع لدرجة عالية من تقلب دفعة. لذلك ، نقدم وسيلة بسيطة ولكنها فعالة للزراعة الكمية لأعداد كبيرة من C. elegans المتزامنة تنمويًا باستخدام لوحات نمو عالية 10 سم. يتضمن التركيب الإعلامي للوحات النمو العالي المزيد من البُرَب من لوحات NGM العادية ويتم زرعها بسلالة الإشريكية القولونية NA22 التي تنمو بقوة أكبر من OP50.
وقد مكنت أوجه التقدم في تكنولوجيا قياس الخلايا تدفق (FACS) التحليل المباشر للمركبات الكهربائية الفردية20،21، مما يسمح بالقياس الكمي للمركبات الكهربائية دون القيود المتأصلة في أساليب أخرى. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن البروتين ليس وكيلا مفيدا لوفرة EV لأن منهجيات تنقية مختلفة تؤدي إلى نسب EV إلى البروتين مختلفة بشكل ملحوظ22. تحتوي كسور EV النقية للغاية على بروتين قليل نسبيًا ، مما يجعل من الصعب قياس العينات باستخدام BCA أو المواد الهلامية Coomassie. يمكن للتحليل الغربي تحديد الاختلافات النسبية للبروتينات الفردية ولكن لا يمكن تحديد عدد المركبات الكهربائية الموجودة في العينة. ويعوق التحديد الكمي القوي لعدد EV عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية نطاقه الضيق من الإشارة إلى الضوضاء، وعدم القدرة على التمييز بين المركبات الكهربائية والمجاميع الصلبة، وعدم إمكانية نقل الأساليب بين الأدوات ذات المواصفات المختلفة23. لذلك، تحتوي هذه المقالة أيضاً على إجراء قياس خلايا التدفق القابل للتعميم للتمييز وتحديد المركبات الكهربائية كمياً.
التحدي الأساسي للحقل EV هو فصل مجموعة واسعة من الأنواع الفرعية EV2. تستخدم الأساليب الموصوفة هنا الترشيح، والطرد المركزي التفاضلي، والكروماتوغرافيا الإقصاء للحجم لتوليد مجموعة نقية من المركبات الكهربائية الصغيرة لأن ~ 100 نانومتر EVs ثبت سابقا أن تفرز في البيئة الخارجية ووظيفة في مسارات الاتصال ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية16. قد لا تزال المركبات الكهربائية المنقاة من خلال الكروماتوغرافيا الإقصاء الحجمية مزيجًا من الاكسوزوسومات والميكروفيسيخالصغيرة الصغيرة لأن هذه الفئات الفرعية EV متشابهة الحجم. عادة ما يتم فصل الفئات الفرعية EV الفقارية عن طريق الترسيب المناعي لأن هذه الطريقة تعزل المركبات الكهربائية من خلال ربط علامات بروتين الغشاء الانتقائي. الطرق الموصوفة تسهيل التعرف على بروتينات علامة غشاء EV C. elegans EV. لذلك ، في المستقبل قد يكون من الممكن زيادة فصل الفئات الفرعية EV الصغيرة من خلال أساليب مماثلة لهطول المناعة. من الناحية النظرية، يمكن أن يعزل الترسيب المناعي المركبات الكهربائية عن الديدان التغذية بشكل جيد لأن E. Coli EVs لا ينبغي أن تتفاعل مع الأجسام المضادة. يمكن للباحثين المهتمين بتحديد البروتين والشحنات الوراثية للفئات الفرعية الأكبر EV (> 200 نانومتر) القيام بذلك عن طريق تخطي خطوة الترشيح 0.22 ميكرومتر ثم تحليل بيليه بدلاً من supernatant. الكشف عن وفرة البروتين والبضائع الوراثية من السيارات الكهربائية الكبيرة سوف يؤسس لفهم أكثر شمولا للعمليات الفسيولوجية التي تعمل من خلال سي elegans secretome. بالإضافة إلى كونها تفرز في البيئة، يتم نقل السيارات الكهربائية C. elegans داخليا بين الأنسجة. لذلك، هذه الأساليب عزل مجموعة فرعية فقط من إجمالي C. elegans EVs. ومع ذلك ، فإن اكتشاف البضائع من المركبات الكهربائية الداخلية غير ممكن لأنه لا توجد طريقة لفصل المركبات الكهربائية عن الديدان الملبدة. تحليل البضائع من هذه المجموعة الفرعية EV تفرز خارجيا يوفر وسيلة لتحديد علامات البروتين EV العامة المحتملة قادرة على وضع العلامات الكهربائية الداخلية كذلك.
يعتمد حجم إعداد EV على متطلبات التجربة. يوفر ما مجموعه 500,000 شاب من البالغين ما يكفي من المركبات الكهربائية لإجراء قياس خلايا التدفق وLC-MS-MS وتحليل RNAseq بالتوازي. يمكن توسيع هذا العدد لأعلى أو لأسفل حسب الاحتياجات التجريبية. أكبر عامل عملي لزيادة هو عدد لوحات النمو 10 سم عالية المطلوبة. لوحات النمو العالي أعدت مع 500 ميكرولتر من 20x مركزة بين عشية وضحاها NA22 الثقافة سوف تدعم السكان من حوالي 50،000 البالغين من مرحلة اليرقات L1 حتى اليوم الأول من مرحلة البلوغ. لذلك ، لإجراء تجربة مع 500،000 شخص بالغ ، هناك حاجة إلى 13 لوحة نمو عالية: لوحة واحدة لتوليد عدد سكان L1s ، ولوحتين لتوليد البالغين للتبييض ، و 10 لوحات لنمو الحيوانات التجريبية. هذه المقاييس هي التي تتوقف على ظروف البذر والنمو البكتيري لوحات النمو العالي. لذلك ، يوصى بصنع جميع اللوحات بطريقة موحدة ثم معايرتها بكميات معروفة من الحيوانات.
يتم حساب الديدان على مرحلتين أثناء عملية الزراعة: 1) قبل البذر الديدان على لوحات و 2) قبل توليد وسائل الإعلام مكيفة. وقد ثبت كثافة زراعة الحيوان للتأثير على السلوك، والتنمية، والاستجابات الإجهاد15،16،17،18 ، وبالتالي ، قد تؤثر أيضا على الشحنات EV. لذلك ، من أجل كثافة زراعة متسقة ، من الضروري تقدير أعداد الديدان بدقة. إن تحديد عدد الديدان في تسع قطرات يعطي الثقة الإحصائية للتقديرات السكانية. من الضروري علاج كل قطرة على حدة ، والدوامة بين كل قطرة وإدراج ماصة نفس المسافة في تعليق الدودة. إن اتخاذ هذه الاحتياطات سيضمن قيم S.E.M. من حوالي 5-10٪ من إجمالي السكان. إذا كانت S.E.M. للمجموعة الدودة أعلى من 20٪، ثم شيء ما ذهب منحرف.
بعد فترة الحضانة خالية من البكتيريا 24 ساعة ، يزحف الشباب من النوع البري C. elegans فورًا بالإضافة إلى العشب البكتيري. وهذا يشير إلى أن الحضانة لا تؤثر بشدة على صحتهم. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة تؤثر على فسيولوجيا الحيوانات وبالتالي قد تؤثر على تكوين شحنات EV. لذلك ، عند العمل مع الأنماط الجينية المريضة جدًا أو الحيوانات القديمة ، من الضروري التحقق من الجدوى بعد خطوة الحضانة. إذا لم تنجو جميع الحيوانات من الحضانة ، فقم بزيادة حجم السكان التجريبي وتقليل وقت الحضانة. عند العمل مع كميات كبيرة من الوسائط المكيفة ، فمن العملي أكثر استخدام مكثف الخلايا التحريكية مع مرشح مصنوع من النيتروسيللوز المتجدد. لا ترتبط المركبات الكهربائية بكيمياء التصفية هذه بقوة مثل أنواع التصفية الأخرى14.
نسبة البروتين الكلي المسترد من وسائل الإعلام مكيفة لعدد الحيوانات المحتضنة لجعل إعداد هو مقياس مفيد. إذا كانت هذه النسبة أعلى بكثير مما كان متوقعا، فمن الممكن أن التقديرات السكانية كانت قبالة أو أن الحيوانات ماتت وتدهورت في وسائل الإعلام مكيفة. إذا كانت هذه النسبة أقل بكثير مما كان متوقعا، ثم بعض البروتين قد فقدت على المرشحات أثناء عملية التركيز. وفي حين أن أساليب نظام مراقبة الأصول الميدانية سوف تحدد مباشرة المركبات الكهربائية في الإعداد، فإن هذا المقياس مفيد لأنه يمكن أن يسلط الضوء على شذوذ العينة في وقت مبكر من العملية. طريقة أخرى مفيدة للتحقق من جودة إعداد EV هو المجهر الإلكتروني انتقال، كما هو مبين في الشكل 4D. على الرغم من أن بروتوكول المجهر الإلكتروني الإرسال لم يتم تضمينها رسميا في هذه المادة أساليب بسبب طول، فإنه يمكن أن يتم بالطرق القياسية. ويوصى بإجراء هذا النوع من التحليل، في البداية على الأقل، كطريقة مجانية لنظام مراقبة الأصول الميدانية لتقييم نوعية مستحضرات EV. للحصول على أفضل النتائج استخدام شبكات formvar الكربون ية حديثا ووصمة عار العينات مع حمض فوسفوالتنغستن 2٪ بدلا من خلات uranyl.
تم اختيار DI-8-ANEPPS لأنه ثبت أن تسمية الأغشية EV كميا، متفوقا على غيرها من الأصباغ EV العامة مع عينات خزعة الإنسان والليبوزومات25. القياسات سريعة ، مع 3 دقيقة فقط من وقت جمع كل عينة. إن التحديد الكمي للمركبات الكهربائية الحساسة للمنظفات له أهمية وظيفية مباشرة لأنه يستفيد من التمييز المادي الأساسي بين المركبات الكهربائية ومجاميع البروتين الدهني الصلبة. الأهم من ذلك، لا تتأثر هذه الطريقة بكمية البروتين الكلي أو عدد المجاميع غير EV، وبالتالي يمكن تحديد كمية المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من خلال طرق تنقية مختلفة بطريقة غير متحيزة. سيكون مقياس EV الذي تم التحقق منه من FACS الذي نصفه هنا مفيدًا بشكل خاص للدراسات التي توضح الآثار الفسيولوجية للمركبات الكهربائية المنقىة. كما يمكن أن يفيد مجال EV بشكل عام لوضع منهجية FACS كمقياس عالمي بحيث يمكن مقارنة وفرة EV المطلقة مباشرة عبر الدراسات. يمكن أن تسمية الأصباغ الحيوية C. elegans EVs ، ولكنها ليست مشرقة مثل السيارات الكهربائية المسماة مع Di-8-ANEPPS.
يستفيد هذا النهج التنقية من الإفراز النشط للمركبات الكهربائية خارج أجسام الديدان الحية السليمة. وهذا يسمح C. elegans EVs لتكون معزولة في نقاء ووفرة مماثلة اعتبارا من ثقافة الخلية, المواصفات التي هي كافية لتحديد مئات من البروتين وشحنات الحمض النووي الريبي عبر LC-MS-MS وRNAseq تحليل26. وهكذا، يمكن الاستفادة من المكتبة الكبيرة من الكواشف المتاحة لبحوث C. elegans للتحقيق في تأثير الاضطراب الوراثي والفسيولوجي على تكوين البضائع EV.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ننوه بامتنان لـ”نك تيرزوبولوس” للوحات الديدان والكواشف؛ ونقدّم امتناننا لـ”نَكِر” “ب”الديدان” و”الكواشف” مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) في مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440) لخط النيماتودا N2؛ لوسيا فويتك، دكتوراه، للمساعدة في تحليل تتبع الجسيمات النانوية؛ جيسيكا يونغ, دكتوراه, وماري كلير, دكتوراه, دكتوراه, دكتوراه, لhiPSC المستمدة من وسائل الإعلام الخلية مكيفة; واي بانغ للمساعدة في التصوير تيم. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد القومية للصحة P30AG013280 إلى MK وNIH منحة AG054098 إلى JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |