מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis elegans
הפרשה של קרום קטן מאוגד שלפוחיות לתוך הסביבה החיצונית הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי של כל התאים. אלה שלפוחיות ושלפוחית (EVs) פונקציה מחוץ לתא כדי לווסת תהליכים פיזיולוגיים גלובליים על ידי העברת חלבונים, גרעין חומצות, מטבוליטים, ושומנים בין רקמות. EVs משקפים את המצב הפיזיולוגי של תאי המקור שלהם. EVs הם מעורבים יש תפקידים בסיסיים כמעט בכל היבט של בריאות האדם. לכן, החלבון EV והקרגוס גנטית הם נותחו יותר ויותר עבור סמנים בריאותיים של בריאות ומחלות. עם זאת, השדה EV עדיין חסרה מערכת המודל חסרי חוליות מודל המאפשר את המחקר של הרכב מטענים EV. ג. אלגיה מתאימה גם לחקר EV משום שהיא פעילה באופן פעיל EVs מחוץ לגופה לתוך הסביבה החיצונית שלה, המאפשר בידוד נתיישב. מאמר זה מספק את כל המידע הדרוש ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שמות מEVs לסביבה זו, כולל כיצד לעבוד באופן כולל עם אוכלוסיות גדולות מאוד של הגיל-תולעים מסונכרנות, מטהר EVs, ופרוטוקול cy, לנסות באופן ישיר מודד את מספר EVs שלם במדגם מטוהר. כך, הספרייה הגדולה של ריאגנטים גנטי זמין עבור מחקר C. אלגיה ניתן לצותת לחקירת ההשפעות של מסלולים גנטיים תהליכים פיזיולוגיים על הרכב מטענים EV.
הפרשה של ממברנה מאוגד מנשא שלפוחיות (EVs) מקלה על תהליכים פיזיולוגיים גלובליים על ידי פעיל הובלת חלבון ספציפי, חומצות גרעין, מטבוליט, ו מטענים השומנים בין תאים1. תאים מפרישות EVs כי לאורך רצף של גדלים החל 2 יקרומטר או גדול ככל קטן כמו 20 ננומטר2. EVs קטנים (< 200 ננומטר) נלמדים יותר ויותר בשל משתמע מתהליכים פתולוגיים, כולל הפרעות מטבולית, סרטן, מחלות לב וכלי דם, ומחלות ניווניות3,4,5. פתווגיות אלה הוכחו גם להשפיע על חלבון ההרכב הגנטי של EVs מטענים של EVs קטן. לכן, חתימות ביואריקר של הפתולוגיה הם יותר ויותר נחשפים דרך EV מטענים גילוי שיטות כגון LC-ms-ms ו rnaseq6,7,8,9.
ג. אלגיה הייתה מודל חסרי חוליות שימושי לזיהוי מסלולים מסוג EV איתות ששומרו. למשל , כאשר מדובר בדבר הראשון שנראה לראשונה כדי לגרום ל-ev biogenesis בשנת c. אלגיה העוברים, ואת יומן ההומויום האנושי הוכח להשפיע EV שחרור בתאי האדם10,11. ג. אלגיה EVs דווחו לשאת אותות קיפוד הדרושים להתפתחות הקוטיקולה. משלוח של קיפוד ומורגנים אחרים הוכח לשחק תפקיד התפתחותי גדול של EVs, והוא שימור ב zebrafish, עכברים, ובני אדם12,13,14,15. ג. אלגיה מתאימה מאוד לגילוי EV ביוארקר משום שהוא מפריש EVs מחוץ לגופה הפועל בתקשורת חיה-לבעלי חיים16,17 (איור 1א). עם זאת, המתודולוגיה שהוקמה באמצעות מחקר הקודם לא ניתן להשתמש מכיוון מקור המזון E. coli גם מפריש EVs18. בשיטה זו, רוב המדגם מורכב של E. coli זיהום, הגבלת העוצמה של הגישות הפרוטאומית או RNAseq לגילוי של C. אלגיה EV cargos. השיטות המתוארות כאן פותחו כדי להניב מאוד טהור C. אלגיה EVs ברמות שפע אופייני של תרבות התא טיפוסי ניסויים ובכך להקל גישות omics עבור גילוי ביואריקר EV.
אוכלוסיות גדולות של תולעים נדרשות כדי לייצר מספר מספיק של EVs עבור ניתוח מטענים. לכן , כלולים גם שיטות לביצוע טיפוח כמותי של אוכלוסיות גדולות בפיתוח מבחינה כמותית. בדרך כלל, כאשר מספר גדול של תולעים נחוצים עבור ניסויים, הם מתורבתים במדיה נוזלית. בעוד זה יעיל ליצירת אוכלוסיות גדולות של תולעים, הפיזיולוגיה של בעלי חיים שונה באופן משמעותי מתולעים מעובדות בתנאים סטנדרטיים על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) אגר צלחות. בעלי חיים שאינם מתורבתים בנוזל גדלים לאט יותר, הם דקים יותר, מציגים טרוגניות התפתחותיים, וחשופים לרמה גבוהה של השתנות אצווה. לכן, אנו מציגים אמצעי פשוט אך יעיל לטיפוח כמותי של אוכלוסיות גדולות של מסונכרן מבחינה נפשית באמצעות לוחיות גידול גבוהות של 10 ס מ. הרכב המדיה של צלחות צמיחה גבוהה כולל יותר peptone מאשר לוחיות הזיהוי הרגיל של ngm והיא מתחזקת עם הזן E. coli NA22 אשר גדל יותר מכבש מ OP50.
ההתקדמות של הטכנולוגיה cyEVs try (facs) אפשרה ניתוח ישיר של הפרט20,21, המתיר כימות הEVs ללא המגבלות הטמונות בשיטות אחרות. עבודה קודמת הראו כי חלבון הוא לא פרוקסי שימושי עבור השפע EV משום שיטות טיהור שונות תוצאה באופן משמעותי שונים EV-to-חלבון יחס22. מאוד טהור שברים EV מכילים קצת חלבון יחסית, מה שהופך אותו קשה לכמת דגימות עם ה-BCA או ג’לים Coomassie. ניתוח מערבי יכול לזהות הבדלים יחסיים של חלבונים בודדים, אך אין באפשרותם לזהות כמה EVs נמצאים במדגם. כימות חזקה של מספר EV על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק הוא הקשיח על ידי טווח צר שלה האות אל הרעש, חוסר יכולת להבדיל בין EVs ואגרגטים מוצק, ואת חוסר ההעברה של שיטות בין מכשירים עם מפרטים שונים23. לכן, מאמר זה מכיל גם הליך הניתן להתאמה כללי של הזרם cyEVs להפלות ולכמת את.
אתגר בסיסי של השדה EV הוא הפרדת מגוון רחב של EV תת2. השיטות המתוארות כאן להשתמש בסינון, צנטריפוגה דיפרנציאלי, וגודל כרומטוגרפיה הדרה כדי לייצר אוכלוסייה טהורה של EVs קטן מכיוון ~ 100 ננומטר EVs הוכחו בעבר להיות מופרש לתוך הסביבה החיצונית ותפקוד במסלולים הקשורים מבחינה פיזיולוגית תקשורת16. EVs מטוהרים באמצעות גודל כרומטוגרפיה הדרה יכול עדיין להיות תערובת של אקסוזומים ומיקרושלפוחיות קטנות כי אלה מחלקות EV הם בגודל דומה. בעלי חוליות מחלקות EV מופרדים בדרך כלל על ידי immunoprecipitation משום שיטה זו מבודדת EVs באמצעות קשירה סמנים בררני חלבון ממברנה. השיטות שתוארו להקל על זיהוי של C. אלגיה EV ממברנה סמן חלבונים. לכן, בעתיד ניתן יהיה להפריד בנפרד ממחלקות EV קטנות באמצעות שיטות immunoprecipitation מקבילה. בתאוריה, immunoprecipitation יכול לבודד EVs מפני תולעים מוזן היטב כי E. coli EVs לא צריך לקיים אינטראקציה עם הנוגדן. החוקרים מעוניינים לזהות את החלבון ואת מטענים הגנטי של מחלקות EV גדול יותר (> 200 ננומטר) יכול לעשות זאת על ידי דילוג על צעד סינון 0.22 יקרומטר ולאחר מכן ניתוח את הגלולה במקום supernatant. חשיפת החלבון ומטעני המטענים הגנטיים של EVs גדולים תקים הבנה מקיפה יותר של התהליכים הפיזיולוגיים הפועלים באמצעות משפטי ה . בנוסף לעובדה שהוא מופרש לתוך הסביבה, EVs הג מועברים באופן פנימי בין רקמות. לכן, שיטות אלה מבודדים רק קבוצת משנה של סה כ EVs. עם זאת, גילוי מטענים של EVs פנימי אינו אפשרי משום שאין שיטה להפרדת EVs מתולעים ליsed. ניתוח מטענים של הקבוצה הזאת מופרש מבחוץ EV מספק אמצעי לזהות פוטנציאל כללי החלבון EV סמנים מסוגל תיוג פנימי EVs כמו גם.
קנה המידה של ההכנה של EV יהיה תלוי בדרישות של הניסוי. סך של 500,000 מבוגרים צעירים מספק מספיק EVs לניהול הזרימה cy try, LC-MS-MS, ו RNAseq ניתוח במקביל. ניתן לשנות מספר זה למעלה או למטה בהתאם לצרכים הניסיוניים. הגורם המעשי הגדול ביותר לשינוי גודל הוא מספרם של 10 ס”מ לוחות גידול גבוה הנדרש. לוחות צמיחה גבוהה מוכן עם 500 μL של 20x מרוכז לילה NA22 התרבות תתמוך באוכלוסיה של ~ 50,000 מבוגרים משלב הזחל L1 עד היום הראשון של הבגרות. לכן, כדי לבצע ניסוי עם 500,000 מבוגרים, 13 לוחות צמיחה גבוהה נדרשים: צלחת אחת כדי לייצר את האוכלוסייה של L1s, שתי צלחות כדי לייצר את המבוגרים עבור הלבנת, ו 10 צלחות לצמיחת החיות ניסיוני. מדדים אלה מותנה הצמיחה בקטריאלי התנאים הגידול של לוחיות הצמיחה גבוה. לכן, מומלץ להפוך את כל הצלחות באופן מתוקננת ולאחר מכן לכייל עם כמויות ידועות של בעלי חיים.
התולעים נספרות בשני שלבים במהלך תהליך הטיפוח: 1) לפני זריעת תולעים על צלחות ו -2) לפני יצירת המדיה הממוזגת. צפיפות בעלי חיים הוכח להשפיע על התנהגות, פיתוח, ואת התגובות הלחץ15,16,17,18 ואולי, לכן, גם להשפיע EV cargos. לכן, בהתאם לצפיפות הטיפוח העקבית, יש צורך להעריך במדויק את אוכלוסיית התולעים. בדיקת מספר התולעים בתשע טיפות מעניקה ביטחון סטטיסטי לאומדנים על האוכלוסייה. זה חיוני לטפל בכל טיפה בנפרד, והוא בין כל טיפה והכנסת את הצינורות באותו מרחק לתוך השעיית התולעת. נקיטת אמצעי זהירות אלה יבטיחו ערכי S.E.M. של ~ 5 – 10% מכלל האוכלוסיה. אם S.E.M. עבור אוכלוסיית התולעת גבוהה מ-20%, אז משהו השתבש.
לאחר 24 שעות הדגירה הנטולת חיידקים, צעיר, פראי סוג C. אלגיה לזחול מיד בנוסף על מדשאה חיידקית. הדבר מעיד על כך שהדגרה אינה משפיעה באופן חמור על בריאותם. עם זאת, צעד זה משפיע על הפיזיולוגיה של בעלי החיים ולכן עשוי להשפיע על הרכבו של cargos EV. לכן, כאשר עובדים עם גנוטיפים חולים מאוד או בעלי חיים מבוגרים, זה הכרחי לבדוק את הכדאיות לאחר שלב הדגירה. אם כל החיות אינן שורדות את הדגירה, אז להגדיל את גודל האוכלוסייה ניסיוני ולהקטין את זמן הדגירה. בעבודה עם כמויות גדולות של מדיה ממוזגת, זה מעשי יותר להשתמש ברכז התאים מעורבב עם מסנן עשוי מחדש ניטרוצלולוזה. EVs לא לאגד לכימיה מסנן זה בחוזקה כמו סוגי סינון אחרים14.
היחס של החלבון הכולל התאושש מהמדיה הממוזגת למספר בעלי החיים המאבקים כדי להפוך את ההכנה הוא מדד שימושי. אם יחס זה גבוה בהרבה מהצפוי, ייתכן שהערכות האוכלוסייה היו כבוי או שבעלי חיים מתו והתדרדרו באמצעי התקשורת הממוזגים. אם יחס זה נמוך בהרבה מהצפוי, ייתכן שחלבון מסוים אבד על המסננים במהלך תהליך הריכוז. בעוד שיטות FACS יהיה ישירות לכמת את EVs בהכנה, מדד זה הוא שימושי כי זה יכול להדגיש חריגות לדוגמה בשלב מוקדם בתהליך. עוד שיטה שימושית לאימות איכות ההכנה של EV היא שידור אלקטרון מיקרוסקופ, כפי שמוצג באיור 4D. למרות שהפרוטוקול של מיקרוסקופ אלקטרוני שידור אינו נכלל באופן רשמי בסעיף שיטות זה עקב אורך, זה יכול להתבצע על ידי שיטות סטנדרטיות. מומלץ לנהל סוג זה של ניתוח, לפחות בתחילה, כשיטה חינם FACS להערכת איכות ההכנות EV. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להשתמש ברשתות formvar משוחררים טרי-פחמן וכתמים את הדגימות עם 2% חומצה phosphotungstic במקום אצטט uranyl.
DI-8-ANEPPS נבחר משום שהוא הוכח ככמת ממברנות EV, מחוץ ביצוע צבעים אחרים EV כללי עם דגימות ביופסיה אנושית ו ליפוזומים25. המדידות מהירות, לקיחת רק 3 דקות של איסוף זמן עבור כל מדגם. הקוונפיקציה של EVs רגיש לניקוי יש משמעות פונקציונלית ישירה כי הוא הפיכת על הבחנה פיזית בסיסית בין EVs ליפופרוטאין מוצק אגרגטים. חשוב מכך, שיטה זו אינה מושפעת כמות החלבון הכולל או מספר של אגרגטים שאינם EV ולכן יכול לכמת EVs שהתקבלו באמצעות שיטות טיהור שונות בצורה לא משוחדת. מטרי ה-EV מאומת המדד אנו מתארים כאן יהיה שימושי במיוחד עבור מחקרים המפגינים השפעות פיזיולוגיות של EVs מטוהרים. זה יכול גם להועיל בשדה EV באופן כללי כדי להקים מתודולוגיה FACS כמדד אוניברסלי, כך מוחלט EV הריקודים המוחלט ניתן להשוות באופן ישיר על פני הלימודים. צבעים חיוניים יכולים גם לתייג את C. אלגיה EVs, אבל הם לא בהירים כמו EVs מתויג עם די-8-anepps.
גישה זו לטיהור מהווה הפיכת הפרשה הפעילה של EVs מחוץ לגופם של תולעים חיות שלמות. זה מתיר C. אלגיה EVs להיות מבודדים בטוהר דומה ושפע כמו מתרבות התא, מפרטים כי הם מספיקים לזיהוי מאות חלבון ו-RNA מטענים באמצעות LC-ms-ms ו rnaseq ניתוח26. כך, הספרייה הגדולה של ריאגנטים זמין עבור מחקר C. אלגיה יכול להיות ממונפת על חקירת ההשפעה של הניתוח הגנטי והפיזיולוגי על הרכב מטענים EV.
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים בהכרת ניק טרזפולוס עבור לוחיות התולעים והריאגנטים; המרכז הגנטיקה של caenorhabditis (cgc) במשרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440) עבור הקו N2 נמטודות; לוסיה וויטק, PhD, לסיוע בניתוח המעקב הננו-חלקיק; ג’סיקה יאנג, PhD, ומארי קלייר, MD, PhD, עבור מדיה תאית ממוזגת הנגזרת מפני היפנוסק; וואי פאנג לסיוע עם הדמיה TEM. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק P30AG013280 כדי MK ו NIH גרנט AG054098 כדי JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |