Questo articolo presenta metodi per generare, purificare e quantificare le vesciche extracellulari di Caenorhabditis elegans elegans.
La secrezione di piccole vesciche legate alla membrana nell’ambiente esterno è un processo fisiologico fondamentale di tutte le cellule. Queste vesciche extracellulari (EV) funzionano al di fuori della cellula per regolare i processi fisiologici globali trasferendo proteine, acidi nucleici, metaboliti e lipidi tra i tessuti. I veicoli elettrici riflettono lo stato fisiologico delle loro cellule di origine. I veicoli elettrici sono implicati per avere ruoli fondamentali in quasi tutti gli aspetti della salute umana. Pertanto, le proteine EV e i carichi genetici vengono sempre più analizzati per ottenere biomarcatori di salute e malattia. Tuttavia, il campo EV manca ancora di un sistema di modelli di invertebrati trattabili che permetta lo studio della composizione del carico EV. C. elegans è adatto per la ricerca EV perché secerne attivamente i veicoli elettrici al di fuori del suo corpo nel suo ambiente esterno, permettendo un facile isolamento. Questo articolo fornisce tutte le informazioni necessarie per generare, purificare e quantificare questi EV C. elegans secreti dall’ambiente, incluso come lavorare quantitativamente con popolazioni molto grandi di worm sincronizzati con età, purificare i VE e un protocollo di citometria di flusso che misura direttamente il numero di EV intatti nel campione purificato. Così, l’ampia biblioteca di reagenti genetici disponibili per la ricerca C. elegans può essere sfruttata per studiare l’impatto dei percorsi genetici e dei processi fisiologici sulla composizione del carico EV.
La secrezione di vesciche extracellulari (EV) legate alla membrana facilita i processi fisiologici globali trasportando attivamente proteine specifiche, acido nucleico, metaboliti e carichi lipidici tra le cellule1. Le cellule secernono eV che si estendono su un continuum di dimensioni che vanno da 2 m o superiore a piccolo come 20 nm2. I piccoli Veicoli elettrici (<200 nm) sono sempre più studiati a causa delle loro implicazioni nei processi patologici, tra cui disturbi metabolici, cancro, malattie cardiovascolari e malattie neurodegenerative3,4,5. Queste patologie hanno anche dimostrato di influenzare la proteina e la composizione genetica dei carichi evasi di piccoli veicoli elettrici. Pertanto, le firme dei biomarcatori della patologia sono sempre più scoperte attraverso metodi di scoperta del carico EV come LC-MS-MS e RNAseq6,7,8,9.
C. elegans è stato un utile modello invertebrato per identificare i percorsi di segnalazione EV evolutivamente conservati. Per esempio, un C. elegans flippase è stato indicato per la prima volta per indurre la biogenesi EV in embrioni di C. elegans, e l’omolologo umano ha dimostrato di influenzare il rilascio di EV nelle cellule umane10,11. C. elegans EV sono stati segnalati per trasportare segnali di riccio necessari per lo sviluppo cuticola. La consegna di Riccio e altri morfogeni è stato indicato per svolgere un ruolo di sviluppo importante di EV, ed è conservato in pesci zebra, topi, e gli esseri umani12,13,14,15. C. elegans è adatto per la scoperta di biomarcatori EV perché secerne EV al di fuori del suo corpo che funzionano nella comunicazione animale-animale16,17 (Figura 1A). Tuttavia, la metodologia stabilita attraverso uno studio precedente non può essere utilizzata perché la fonte alimentare E. coli dei nematodi secerne anche eV18. In questo metodo, la maggior parte del campione è costituita da contaminazione da E. coli, che limita la potenza degli approcci proteomici o RNAseq per la scoperta dei carichi C. elegans EV. I metodi qui descritti sono stati sviluppati per produrre EV C. elegans altamente puri a livelli di abbondanza caratteristici dei tipici esperimenti di coltura cellulare e quindi facilitare gli approcci omici per la scoperta di biomarcatori EV.
Sono necessarie grandi popolazioni di vermi per generare un numero sufficiente di veicoli elettrici per l’analisi del carico. Pertanto, sono inclusi anche metodi per condurre la coltivazione quantitativa di grandi popolazioni di C. elegan sincronizzati allo stesso modo. Tipicamente, quando un gran numero di vermi sono necessari per gli esperimenti, sono coltivati in supporti liquidi. Mentre questo è efficace per generare grandi popolazioni di vermi, la fisiologia degli animali è notevolmente diversa dai vermi coltivati in condizioni standard su piastre di agar nematodio (NGM). Gli animali coltivati nel liquido crescono più lentamente, sono più sottili, mostrano eterogeneità dello sviluppo e sono soggetti a un alto grado di variabilità del lotto. Pertanto, presentiamo un mezzo semplice ma efficace per la coltivazione quantitativa di grandi popolazioni di C. elegansincronizzai sincronizzati con sviluppo utilizzando piastre di crescita elevate 10 cm. La composizione mediatica di piastre ad alta crescita include più peptone rispetto alle normali piastre NGM e vengono seminato con il ceppo E. coli NA22 che cresce più robusto di OP50.
I progressi nella tecnologia della citometria di flusso (FACS) hanno permesso l’analisi diretta dei singoli eV20,,21, consentendo la quantificazione dei veicoli elettrici senza le limitazioni intrinseche di altri metodi. Il lavoro precedente ha dimostrato che la proteina non è un proxy utile per l’abbondanza di EV, perché diverse metodologie di purificazione si traducono in rapporti EV-proteina significativamente diversi22. Le frazioni EV estremamente pure contengono proteine relativamente poche, il che rende difficile quantificare i campioni con gel BCA o Coomassie. L’analisi occidentale può identificare differenze relative di singole proteine, ma non può identificare il numero di VE nel campione. La robusta quantificazione del numero EV mediante l’analisi del tracciamento delle nanoparticelle è ostacolata dalla sua ristretta gamma segnale-rumore, dall’incapacità di distinguere tra eve e aggregati solidi e dalla mancanza di trasferibilità dei metodi tra strumenti con specifiche diverse23. Pertanto, questo articolo contiene anche una procedura citometrica di flusso generalizzabile per la discriminazione e la quantificazione dei veicoli elettrici.
Una sfida fondamentale del settore EV è separare l’ampia varietà di sottotipi EV2. I metodi qui descritti utilizzano la filtrazione, la centrifugazione differenziale e la cromatografia ad esclusione di dimensioni per generare una popolazione pura di piccoli veicoli elettrici, in quanto in precedenza sono stati mostrati essere secreti nell’ambiente esterno e funzionare in percorsi di comunicazione fisiologicamente rilevanti16. I veicoli elettrici purificati attraverso la cromatografia ad esclusione di dimensioni possono ancora essere una miscela di esosomi e piccoli microvescicoli perché queste sottoclassi EV sono di dimensioni simili. Le sottoclassi Di EV vertebrate sono comunemente separate dall’immunoprecipitazioni perché questo metodo isola gli EV mediante il legame ai marcatori selettivi delle proteine della membrana. I metodi descritti facilitano l’identificazione delle proteine del marcatore della membrana C. elegans EV. Pertanto, in futuro potrebbe essere possibile separare ulteriormente piccole sottoclassi EV attraverso metodi di immunoprecipitazioni analoghi. In teoria, l’immunoprecipitazioni potrebbe isolare i veicoli elettrici dai vermi ben nutriti perché gli E. coli EV non dovrebbero interagire con gli anticorpi. I ricercatori interessati a identificare le proteine e i carichi genetici delle sottoclassi EV più grandi (>200 nm) possono farlo saltando la fase di filtrazione di 0,22 m e quindi analizzando il pellet piuttosto che il supernatante. Scoprire le proteine e l’abbondanza genetica di carico dei grandi veicoli elettrici stabilirà una comprensione più completa dei processi fisiologici che funzionano attraverso il secretome C. elegans. Oltre ad essere secreti nell’ambiente, c. elegans EV vengono trasferiti internamente tra i tessuti. Pertanto, questi metodi isolano solo un sottoinsieme dei VE C. elegans totali. Tuttavia, la scoperta del carico dei veicoli elettrici interni non è possibile perché non esiste un metodo per separare i veicoli elettrici dai vermi lisci. L’analisi del carico di questo sottoinsieme EV secreto esternamente fornisce un mezzo per identificare i potenziali marcatori proteici EV generali in grado di etichettare anche i veicoli elettrici interni.
La portata della preparazione del vela dipenderà dalle esigenze dell’esperimento. Un totale di 500.000 giovani adulti fornisce un numero sufficiente di veicoli elettrici per condurre la citometria del flusso, l’LC-MS-MS e l’analisi degli RNAaseq in parallelo. Questo numero può essere scalato verso l’alto o verso il basso a seconda delle esigenze sperimentali. Il più grande fattore pratico per la scalabilità verticale è il numero di piastre di crescita alte 10 cm. Le placche ad alta crescita preparate con 500. Pertanto, per condurre un esperimento con 500.000 adulti, sono necessarie 13 piastre ad alta crescita: una piastra per generare la popolazione di L1, due piastre per generare gli adulti per lo sbiancamento e 10 piastre per la crescita degli animali sperimentali. Queste metriche dipendono dalle condizioni di seeding e crescita batterica delle piastre ad alta crescita. Pertanto, si consiglia di fare tutte le piastre in modo standardizzato e quindi calibrare con quantità note di animali.
I vermi vengono conteggiati in due fasi durante il processo di coltivazione: 1) prima di seminare vermi su piastre e 2) prima di generare il supporto condizionato. È stato dimostrato che la densità di coltivazione animale influisce sul comportamento, lo sviluppo e le risposte allo stress15,16,1717,18 e possono, quindi, influenzare anche i carichi EV. Pertanto, per una densità di coltivazione coerente è necessario stimare con precisione le popolazioni di vermi. Quantificare il numero di vermi in nove gocce dà la fiducia statistica delle stime della popolazione. È essenziale trattare ogni goccia singolarmente, vortice tra ogni goccia e inserendo la pipetta alla stessa distanza nella sospensione del verme. L’assunzione di queste precauzioni garantirà valori S.E.M. del 5-10% della popolazione totale. Se lo S.E.M. per una popolazione di vermi è superiore al 20%, allora qualcosa è andato storto.
Dopo il periodo di incubazione privo di batteri di 24 h, giovani, selvatici di tipo C. elegan strisciano immediatamente dopo l’aggiunta a un prato batterico. Ciò indica che l’incubazione non influisce gravemente sulla loro salute. Tuttavia, questo passo influenza la fisiologia degli animali e quindi può influenzare la composizione dei carichi EV. Pertanto, quando si lavora con genotipi molto malati o animali più anziani, è essenziale verificare la fattibilità dopo la fase di incubazione. Se tutti gli animali non sopravvivono all’incubazione, aumentare le dimensioni della popolazione sperimentale e diminuire il tempo di incubazione. Quando si lavora con grandi volumi di supporti condizionati, è più pratico utilizzare un concentratore a cellule agitate con un filtro in nitrocellulosa rigenerata. Gli eV non si legano a questa chimica del filtro con la stessa intensità di altri tipi di filtro14.
Il rapporto tra la proteina totale recuperata dai supporti condizionati e il numero di animali incubati per preparare la preparazione è una metrica utile. Se questo rapporto è molto più alto del previsto, è possibile che le stime della popolazione fossero fuori o che gli animali siano morti e deteriorati nei mezzi di comunicazione condizionati. Se questo rapporto è molto più basso del previsto, allora alcune proteine potrebbero essere state perse sui filtri durante il processo di concentrazione. Mentre i metodi FACS quantificano direttamente i veicoli elettrici nella preparazione, questa metrica è utile perché può evidenziare anomalie campione nelle prime fasi del processo. Un altro metodo utile per verificare la qualità della preparazione EV è la microscopia elettronica di trasmissione, come illustrato nella Figura 4D. Anche se il protocollo per la microscopia elettronica di trasmissione non è formalmente incluso in questo articolo metodi a causa della lunghezza, può essere condotto con metodi standard. Si raccomanda di condurre questo tipo di analisi, almeno inizialmente, come metodo gratuito per FACS per valutare la qualità dei preparati EV. Per ottenere i migliori risultati utilizzare griglie formvar-carbonio appena scaricate e macchiare i campioni con 2% di acido fosforico al posto di acetato di uranilo.
DI-8-ANEPPS è stato scelto perché ha dimostrato di etichettare quantitativamente le membrane EV, sovraperformando altri coloranti EV generali con campioni di biopsia umana e liposomi25. Le misure sono veloci, prendendo solo 3 minimo di tempo di raccolta per ogni campione. La quantificazione dei VE sensibili al detersivo ha un significato funzionale diretto perché sfrutta una distinzione fisica fondamentale tra ev e aggregati di lipoproteina solida. È importante sottolineare che questo metodo non è influenzato dalla quantità di proteine totali o dal numero di aggregati non EV e pertanto può quantificare gli EV ottenuti attraverso diversi metodi di purificazione in modo imparziale. La metrica EV verificata da FACS che descriviamo qui sarebbe particolarmente utile per gli studi che dimostrano impatti fisiologici dei veicoli elettrici purificati. Potrebbe anche essere vantaggioso il campo EV in generale stabilire una metodologia FACS come metrica universale in modo che l’abbondanza assoluta di EV possa essere confrontata direttamente tra gli studi. I coloranti vitali possono anche etichettare C. elegans EV, ma non sono brillanti come eV etichettati con Di-8-ANEPPS.
Questo approccio di purificazione sfrutta la secrezione attiva dei veicoli elettrici al di fuori dei corpi di vermi viventi intatti. Ciò consente acve C. elegans EV di essere isolati a purezza e abbondanza comparabili a partire dalla coltura cellulare, specifiche che sono sufficienti per identificare centinaia di carichi di proteine e RNA tramite l’analisi LC-MS-MS e RNAseq26. Così, l’ampia libreria di reagenti disponibili per la ricerca c. elegans può essere sfruttata per studiare l’influenza della perturbazione genetica e fisiologica sulla composizione del carico EV.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo con gratitudine Nick Terzopoulos per le piastre di vermi e i reagenti; il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) presso l’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440) per la linea n2 nematode; Lucia Vojtech, PhD, per assistenza con l’analisi del monitoraggio delle nanoparticelle; Jessica Young, PhD, e Marie Claire, MD, PhD, per supporti cellulari condizionati neuronali derivati da hiPSC; Wai Pang per assistenza con l’imaging TEM. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH P30AG013280 a MK e dalla sovvenzione NIH AG054098 a JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |