Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.
Küçük zara bağlı veziküllerin dış ortama salgıları tüm hücrelerin temel fizyolojik sürecidir. Bu hücre dışı veziküller (EVs) dokular arasında proteinler, nükleik asitler, metabolitler ve lipidler aktararak küresel fizyolojik süreçleri düzenlemek için hücre dışında işlev. EvV’ler menşe hücrelerinin fizyolojik durumunu yansıtır. EVs insan sağlığının hemen hemen her alanında temel rolleri var ima edilmektedir. Böylece, EV protein ve genetik kargolar giderek sağlık ve hastalık biyobelirteçleri için analiz edilmektedir. Ancak, EV alanında hala EV kargo kompozisyonu çalışma izin veren bir çekilebilir omurgasız model sistemi yoksundur. C. elegans EV araştırmaları için çok uygundur, çünkü aktif olarak vücudunun dışında, dış ortama eVs salgılar, kolay izolasyon izin. Bu makalede, bu çevreye duyarlı C. elegans EVs oluşturmak, arındırmak ve ölçmek için gerekli tüm bilgileri sağlar nasıl yaş senkronize solucanların çok büyük popülasyonları ile nicel çalışma dahil olmak üzere, EVs arındırıcı, ve doğrudan saflaştırılmış örnek bozulmamış EVs sayısını ölçen bir akış sitometri protokolü. Böylece, C. elegans araştırma için mevcut genetik reaktifler büyük kütüphane EV kargo bileşimi üzerinde genetik yollar ve fizyolojik süreçlerin etkilerini araştırmak için içine dokundu olabilir.
Membrana bağlı ekstrasellüler (EVs) salgılanması aktif hücreler arasında belirli protein, nükleik asit, metabolit ve lipid kargoları taşıyarak küresel fizyolojik süreçleri kolaylaştırır1. Hücreler 2 μm veya daha büyük boyutlarda bir süreklilik kapsayan EVs salgılar 20 nm2kadar küçük. Küçük EVs (<200 nm) giderek metabolik bozukluklar, kanser, kardiyovasküler hastalık ve nörodejeneratif hastalıklar3dahil patolojik süreçlerde kendi sonucu nedeniyle çalışılır 3,4,5. Bu patolojilerin küçük EVs kargolarının protein ve genetik bileşimini etkilediği gösterilmiştir. Bu nedenle, patolojinin biyomarker imzaları giderek LC-MS-MS ve RNAseq6,7,,8,9gibi EV kargo keşif yöntemleri ile ortaya çıkarılmaktadır.
C. elegans evrimsel olarak korunmuş EV sinyal yollarını tanımlamak için yararlı bir omurgasız model olmuştur. Örneğin, bir C. elegans flippase ilk C. elegans embriyolarda EV biyogenezini indüklemek için gösterilmiştir, ve insan homolog insan hücrelerinde EV salınımını etkilemek için gösterilmiştir10,11. C. elegans EVs miğfonel gelişimi için gerekli Kirpi sinyalleri taşımak bildirilmiştir. Kirpi ve diğer morfojenlerin teslimat EVs önemli bir gelişimsel rol oynadığı gösterilmiştir, ve zebra balığı korunur, fareler, ve insanlar12,13,14,15. C. elegans ev biyomarker keşfi için uygundur çünkü hayvan-hayvaniletişimindeişlev gören eV’leri vücudunun dışında salgılar 16,17 (Şekil 1A). Ancak, nematodların E. coli besin kaynağı da EVs18salgıladığı için, bir önceki çalışma ile kurulan metodoloji kullanılamaz. Bu yöntemde, numunenin çoğu E. coli kontaminasyonundan oluşur ve C. elegans EV kargolarının keşfi için proteomik veya RNAseq yaklaşımlarının gücünü sınırlar. Burada açıklanan yöntemler, tipik hücre kültürü deneylerinin karakteristik bolluk düzeylerinde son derece saf C. elegans EVs sağlamak ve böylece EV biyomarker keşfi için omik yaklaşımları kolaylaştırmak için geliştirilmiştir.
Kargo analizi için yeterli sayıda EV üretmek için büyük solucan popülasyonlarına ihtiyaç vardır. Bu nedenle, gelişimsel senkronize C. elegans büyük popülasyonların nicel ekimi yapmak için yöntemler de dahildir. Tipik olarak, deneyler için çok sayıda solucangerektiğinde, sıvı ortamda kültürlenirler. Bu solucanların büyük popülasyonları üretmek için etkili olmakla birlikte, hayvanların fizyolojisi nematod büyüme orta (NGM) agar plakaları standart koşullar altında yetiştirilen solucanlar önemli ölçüde farklıdır. Sıvı içinde kültürlenen hayvanlar daha yavaş büyür, daha incedir, gelişimsel heterojenlik gösterir ve yüksek derecede toplu iş değişkenliğine maruz kalmaktadırlar. Bu nedenle, 10 cm yüksek büyüme plakaları kullanarak gelişimsel senkronize C. elegans büyük popülasyonların kantitatif ekimi için basit ama etkili bir araç salıyoruz. Yüksek büyüme plakalarının medya kompozisyonu normal NGM plakalarından daha fazla pepton içerir ve OP50’den daha sağlam büyüyen E. coli suşu NA22 ile tohumlanır.
Akış sitometri teknolojisindeki (FACS) gelişmeler, diğer yöntemlerde doğal sınırlamalar olmaksızın EVs’lerin sayısallaştırılmasına izin veren bireysel EVs20,21’indoğrudan analizini sağlamıştır. Farklı saflaştırma metodolojileri önemli ölçüde farklı EV-protein oranları22neden çünkü önceki çalışma protein EV bolluğu için yararlı bir proxy olmadığını göstermiştir. Son derece saf EV fraksiyonları nispeten az protein içerir, bca veya Coomassie jelleri ile örnekleri ölçmek zor hale. Batı analizi bireysel proteinlerin göreceli farklılıklarını belirleyebilir, ancak örnekte kaç ev olduğunu belirleyemez. EV sayısının nanopartikül izleme analizi ile sağlam bir şekilde ölçülmesi, dar sinyal-gürültü aralığı, EVs ve katı agregalar arasında ayrım yapamama ve farklı özelliklere sahip araçlar arasında yöntemlerin aktarılamaması ile engellenir23. Bu nedenle, bu makalede, evs ayrımcılık ve nicelleştirmek için genelleştirilebilir bir akış sitometrik yordamı da içerir.
EV alanının temel bir sorun EV alttürleri2 geniş bir yelpazede ayıran. Burada açıklanan yöntemler, ~100 nm EVs daha önce fizyolojik olarak ilgili iletişim yolları16dış ortama ve fonksiyon içine salgılanan gösterilmiştir, çünkü küçük EVs saf bir nüfus oluşturmak için filtrasyon, diferansiyel santrifüj ve boyut dışlama kromatografi kullanın. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılan EVs hala ekzozomlar ve küçük mikroveziküllerin bir karışımı olabilir, çünkü bu EV alt sınıfları benzer büyüklüktedir. Omurgalı EV alt sınıfları genellikle immünoprepitasyon ile ayrılır, çünkü bu yöntem evs selektif membran protein belirteçleri bağlama yoluyla izole. Açıklanan yöntemler C. elegans EV membran marker proteinlerinin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Bu nedenle, gelecekte benzer immünopredipredasyon yöntemleri ile küçük EV alt sınıfları daha fazla ayırmak mümkün olabilir. Teorik olarak, immünoyağış iyi beslenen solucanlardan EVs izole edebilir çünkü E. coli EVs antikor ile etkileşime girmemelidir. Daha büyük EV alt sınıflarının (>200 nm) protein ve genetik yüklerini belirlemek isteyen araştırmacılar, bunu 0,22 μm filtrasyon adımını atlayarak ve daha sonra süpernatant yerine peleti analiz ederek yapabilir. Büyük EV’lerin protein ve genetik yük bolluğunun ortaya çıkarılması, C. elegans secretome ile işleyen fizyolojik süreçlerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. C. elegans EVs çevreye salgılanmanın yanı sıra dokular arasında dahili olarak aktarılır. Bu nedenle, bu yöntemler sadece toplam C. elegans EVs bir alt kümesi izole. Ancak, EV’leri lysed solucanlardan ayırmanın bir yöntemi olmadığı için dahili EV’lerin kargo keşfi mümkün değildir. Bu harici salgılanan EV alt kümesinin kargo analizi, dahili EV’leri de etiketleme yeteneğine sahip potansiyel genel EV protein belirteçlerini belirlemek için bir araç sağlar.
EV hazırlığının ölçeği deneyin taleplerine bağlıdır. Toplam 500.000 genç yetişkin, akış sitometrisi, LC-MS-MS ve RNAseq analizini paralel olarak yürütmek için yeterli SAYıDA EV sağlamaktadır. Bu sayı, deneysel ihtiyaçlar bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Ölçekleme için en büyük pratik faktör 10 cm yüksek büyüme plakaları gerekli sayısıdır. 500 μL 20x konsantre gecede NA22 kültürü ile hazırlanan yüksek büyüme plakaları, L1 larva aşamasından yetişkinliğin ilk gününe kadar ~50.000 yetişkinin nüfusunu destekleyecektir. Bu nedenle, 500.000 yetişkin ile bir deney yapmak için, 13 yüksek büyüme plakası gereklidir: L1s nüfusu oluşturmak için bir plaka, ağartma için yetişkinler oluşturmak için iki plaka, ve deneysel hayvanların büyümesi için 10 plaka. Bu ölçümler, yüksek büyüme plakalarının tohumlama ve bakteriyel büyüme koşullarına bağlıdır. Bu nedenle, standart bir şekilde tüm plakalar yapmak ve daha sonra hayvanların bilinen miktarlarda kalibre önerilir.
Solucanlar yetiştirme işlemi sırasında iki aşamada sayılır: 1) plakalar üzerinde solucanlar tohumlama önce ve 2) şartlı ortam oluşturmadan önce. Hayvanyetiştiriciliği yoğunluğu davranış, geliştirme ve stres yanıtları15,16,,17,18 ve bu nedenle, aynı zamanda EV kargoları etkileyebilir etkisi gösterilmiştir. Bu nedenle, tutarlı yetiştirme yoğunluğu için solucan popülasyonlarını doğru bir şekilde tahmin etmek gerekir. Solucan sayısının dokuz damlada ölçülmesi, nüfus tahminlerinin istatistiksel güvenini verir. Her damlayı ayrı ayrı tedavi etmek, her damla arasında girdap ve solucan süspansiyon içine aynı mesafe pipet ekleyerek esastır. Bu önlemlerin alınması, toplam nüfusun ~%5-10’unun S.E.M. değerlerini sağlayacaktır. Eğer bir solucan popülasyonu için S.E.M. %20’den fazlaysa, o zaman bir şeyler ters gitti demektir.
24 saat bakterisiz kuluçka döneminden sonra, genç, yabani tip C. elegans hemen bir bakteri çim ek olarak sürün. Bu, kuluçka nın sağlıklarını ciddi şekilde etkilemediğini gösterir. Ancak, bu adım hayvanların fizyolojisini etkiler ve bu nedenle EV kargolarının bileşimi etkileyebilir. Bu nedenle, çok hasta genotipler veya yaşlı hayvanlarla çalışırken, kuluçka adımından sonra canlılığı kontrol etmek esastır. Eğer tüm hayvanlar kuluçkadan sağ çıkamazsa, o zaman deneysel popülasyon boyutunu artırın ve kuluçka süresini kısaltın. Büyük hacimlerde klimalı ortamla çalışırken, yeniden üretilen nitroselülozdan yapılmış bir filtreile karıştırılmış hücreli konsantratörü kullanmak daha pratiktir. EVs diğer filtre türleri14gibi güçlü olarak bu filtre kimyası bağlamak yok.
Şartlı ortamdan elde edilen toplam proteinin, hazırlık yapmak için kuluçkaya yatan hayvan sayısına oranı yararlı bir ölçümdür. Bu oran beklenenden çok daha yüksekse, popülasyon tahminlerinin kapalı olması veya hayvanların şartlı ortamda ölmüş ve bozulmuş olması mümkündür. Bu oran beklenenden çok daha düşükse, konsantrasyon işlemi sırasında filtrelerde bazı proteinler kaybolmuş olabilir. FACS yöntemleri hazırlık aşamasında Ev’leri doğrudan ölçse de, bu ölçüm işlemin başlarında örnek anomalileri vurgulayabildiği için yararlıdır. EV hazırlığının kalitesini doğrulamak için kullanılan bir diğer yararlı yöntem de Şekil 4D’degösterildiği gibi iletim elektron mikroskobudur. İletim elektron mikroskobu protokolü uzunluk nedeniyle bu yöntem makalesinde resmi olarak yer almasa da standart yöntemlerle yapılabilir. Ev preparatlarının kalitesini değerlendirmek için FACS’ye ücretsiz bir yöntem olarak, en azından başlangıçta bu tür analizlerin yapılması önerilir. En iyi sonuçlar için taze deşarj formvar-karbon ızgaraları kullanın ve uranyl asetat yerine% 2 fosfotungstik asit ile örnekleri leke.
DI-8-ANEPPS, insan biyopsisi örnekleri ve lipozomlar25ile diğer genel EV boyaları daha iyi performans, kantitatif etiket EV membranlar gösterilmiştir çünkü seçildi . Ölçümler, her örnek için toplama süresi sadece 3 dakika alarak, hızlıdır. Deterjana duyarlı EVs’lerin nicelliği doğrudan işlevsel öneme sahiptir, çünkü EVs ve katı lipoprotein agregaları arasındaki temel fiziksel ayrımdan yararlanır. Daha da önemlisi, bu yöntem toplam protein miktarından veya EV dışı agrega sayısından etkilenmez ve bu nedenle farklı arıtma yöntemleri yle elde edilen EVs’leri tarafsız bir şekilde ölçebilir. Burada tanımladığımız FACS onaylı EV ölçümü, arıtılmış EVs’lerin fizyolojik etkilerini gösteren çalışmalar için özellikle yararlı olacaktır. Ayrıca mutlak EV bollukları doğrudan çalışmalar arasında karşılaştırılabilir böylece evrensel bir metrik olarak bir FACS metodolojisi kurmak için genel olarak EV alanında yararlanabilir. Vital boyalar da C. elegans EVs etiketleyebilir, ancak Di-8-ANEPPS ile etiketlenmiş EVs kadar parlak değildir.
Bu arınma yaklaşımı, bozulmamış, yaşayan solucanların vücutları dışında EV’lerin aktif salgılanmasından yararlanılır. Bu, C. elegans EVs hücre kültüründen olarak karşılaştırılabilir saflık ve bolluk izole edilmesine izin verir, LC-MS-MS ve RNAseq analizi26ile protein ve RNA kargoları yüzlerce tanımlamak için yeterli özellikleri. Böylece, C. elegans araştırma için mevcut reaktifler büyük kütüphane EV kargo bileşimi üzerinde genetik ve fizyolojik tedirginlik etkisini araştırmak için kaldıraçlı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Nick Terzopoulos’u solucan plakaları ve reaktifler için minnetle kabul ediyoruz; N2 nematod hattı için NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi’ndeki (P40 OD010440) Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC); Lucia Vojtech, Doktora, nanopartikül izleme analizi ile yardım için; Jessica Young, Doktora, ve Marie Claire, MD, Doktora, hiPSC türetilmiş nöronal şartlı hücre ortamı için; Wai Pang TEM görüntüleme ile ilgili yardım için. Bu çalışma NIH hibe P30AG013280 tarafından MK ve NIH hibe AG054098 JCR tarafından desteklenmiştir.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |