Este artigo apresenta métodos para gerar, purificar e quantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.
A secreção de pequenas vesículas ligadas à membrana no ambiente externo é um processo fisiológico fundamental de todas as células. Essas vesículas extracelulares (EVs) funcionam fora da célula para regular processos fisiológicos globais, transferindo proteínas, ácidos nucleicos, metabólitos e lipídios entre tecidos. Os EVs refletem o estado fisiológico de suas células de origem. Os EVs estão implicados por terem papéis fundamentais em praticamente todos os aspectos da saúde humana. Assim, a proteína EV e as cargas genéticas estão sendo cada vez mais analisadas para biomarcadores de saúde e doenças. No entanto, o campo EV ainda carece de um sistema de modelo invertebrado tratável que permita o estudo da composição da carga EV. C. elegans é adequado para a pesquisa de EV porque secreta ativamente Os EVs fora de seu corpo em seu ambiente externo, permitindo o isolamento fácil. Este artigo fornece todas as informações necessárias para gerar, purificar e quantificar esses EVs C. elegans ambientalmente secretados, incluindo como trabalhar quantitativamente com populações muito grandes de worms sincronizados por idade, purificar EVs e um protocolo de citometria de fluxo que mede diretamente o número de EVs intactos na amostra purificada. Assim, a grande biblioteca de reagentes genéticos disponíveis para a pesquisa de C. elegans pode ser aproveitada para investigar os impactos das vias genéticas e processos fisiológicos na composição da carga EV.
A secreção de vesículas extracelulares ligadas à membrana (EVs) facilita os processos fisiológicos globais transportando ativamente cargas específicas de proteína, ácido nucleico, metabólito e lipídio entre as células1. As células secretam EVs que abrangem um contínuo de tamanhos que variam de 2 μm ou superior a até 20 nm2. Pequenos EVs (<200 nm) são cada vez mais estudados devido à sua implicação em processos patológicos, incluindo distúrbios metabólicos, câncer, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas3,4,5. Essas patologias também têm sido demonstradas para influenciar a proteína e a composição genética de cargas EVs de pequenos EVs. Portanto, as assinaturas biomarcadores da patologia estão cada vez mais sendo descobertas através de métodos de descoberta de carga EV, tais como LC-MS-MS e RNAseq6,,7,,8,9.
C. elegans tem sido um modelo invertebrado útil para identificar vias de sinalização EV conservadas evolutivamente. Por exemplo, uma flippase c. elegans foi mostrada pela primeira vez para induzir a biogênese ev em embriões C. elegans, e o homolog humano foi mostrado para influenciar a liberação de EV em células humanas10,11. C. elegans EVs foram relatados para transportar sinais hedgehog necessários para o desenvolvimento de cutículas. A entrega de Ouriço e outros morfogênios foi demonstrada para desempenhar um papel de desenvolvimento importante dos EVs, e é conservada em zebrafish, camundongos e humanos12,13,14,15. C. elegans é adequado para a descoberta de biomarcadores EV porque secreta EVs fora de seu corpo que funcionam na comunicação animal-animal16,17 (Figura 1A). No entanto, a metodologia estabelecida através de um estudo anterior não pode ser utilizada porque a fonte de alimento E. coli dos nematóides também secreta os EVs18. Neste método, a maior parte da amostra é composta por contaminação por E. coli, limitando o poder das abordagens proteômicas ou RNAseq para a descoberta de cargas De C. elegans EV. Os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para produzir EVs C. elegans altamente puros em níveis de abundância característicos de experimentos típicos de cultura celular e, assim, facilitar abordagens ômicas para a descoberta de biomarcadores EV.
Grandes populações de vermes são necessárias para gerar um número suficiente de EVs para análise de carga. Portanto, também estão incluídos métodos de condução do cultivo quantitativo de grandes populações de C. elegans sincronizados em desenvolvimento. Normalmente, quando um grande número de vermes são necessários para experimentos, eles são cultivados em mídia líquida. Embora isso seja eficaz para gerar grandes populações de vermes, a fisiologia dos animais é consideravelmente diferente dos vermes cultivados em condições padrão em placas de ágar do meio de crescimento de nematóides (NGM). Animais cultivados em líquido crescem mais lentamente, são mais finos, mostram heterogeneidade do desenvolvimento e são submetidos a um alto grau de variabilidade do lote. Portanto, apresentamos um meio simples, mas eficaz para o cultivo quantitativo de grandes populações de C. elegans sincronizados em desenvolvimento utilizando placas de crescimento de 10 cm de altura. A composição da mídia de placas de alto crescimento inclui mais peptoque do que placas NGM regulares e são semeadas com a estirpe E. coli NA22 que cresce mais robustamente do que OP50.
Os avanços na tecnologia de citometria de fluxo (FACS) permitiram a análise direta de EVs individuais20,21, permitindo a quantificação de EVs sem as limitações inerentes em outros métodos. Trabalhos anteriores mostraram que a proteína não é um proxy útil para a abundância de EV porque diferentes metodologias de purificação resultam em relações EV-proteínas significativamente diferentes22. Frações de EV extremamente puras contêm relativamente pouca proteína, dificultando a quantificação de amostras com géis BCA ou Coomassie. A análise ocidental pode identificar diferenças relativas de proteínas individuais, mas não pode identificar quantos EVs existem na amostra. A quantificação robusta do número de EV por análise de rastreamento de nanopartículas é dificultada pela sua estreita faixa de sinal-ruído, pela incapacidade de diferenciar entre EVs e agregados sólidos e pela falta de transferibilidade dos métodos entre instrumentos com diferentes especificações23. Portanto, este artigo também contém um procedimento citométrico de fluxo generalizável para discriminar e quantificar EVs.
Um desafio fundamental do campo EV é separar a grande variedade de subtipos EV2. Os métodos descritos aqui utilizam filtração, centrifugação diferencial e cromatografia de exclusão de tamanho para gerar uma população pura de Pequenos EVs porque ~100 nm EVs foram previamente mostrados como secretados no ambiente externo e funcionam em vias de comunicação fisiologicamente relevantes16. EVs purificados através da cromatografia de exclusão de tamanho ainda podem ser uma mistura de exosóis e microvesículas pequenas porque essas subclasses ev são de tamanho semelhante. As subclasses de VERTEBRAdos EV são comumente separadas pela imunoprecipitação porque este método isola os EVs através da ligação a marcadores de proteína de membrana seletiva. Os métodos descritos facilitam a identificação de proteínas marcadoras de membrana C. elegans EV. Portanto, no futuro, pode ser possível separar ainda mais pequenas subclasses de EV através de métodos análogos de imunoprecipitação. Em teoria, a imunoprecipitação poderia isolar Os EVs de vermes bem alimentados porque os EVs E. coli não devem interagir com o anticorpo. Pesquisadores interessados em identificar as cargas proteicas e genéticas de subclasses maiores de EV (>200 nm) podem fazê-lo pulando a etapa de filtração de 0,22 μm e, em seguida, analisando a pelota em vez do sobrenadante. Descobrir as abundâncias de proteínas e cargas genéticas de grandes EVs estabelecerá uma compreensão mais abrangente dos processos fisiológicos que funcionam através do C. elegans secretome. Além de serem secretados no ambiente, os EVs C. elegans são transferidos internamente entre tecidos. Portanto, esses métodos apenas isolam um subconjunto de EVs C. elegans totais. No entanto, a descoberta de carga de EVs internos não é possível porque não há método para separar Os EVs de worms lysed. A análise de carga deste subconjunto EV secretado externamente fornece um meio para identificar potenciais marcadores de proteína EV gerais capazes de rotular EVs internos também.
A escala da preparação do EV dependerá das demandas do experimento. Um total de 500.000 jovens adultos fornece EVs suficientes para a realização de citometria de fluxo, LC-MS-MS e análise RNAseq em paralelo. Este número pode ser ampliado para cima ou para baixo, dependendo das necessidades experimentais. O maior fator prático para a ampliação é o número de placas de crescimento de 10 cm de altura necessárias. Placas de alto crescimento preparadas com 500 μL de 20x concentrados durante a noite cultura NA22 apoiarão uma população de ~50.000 adultos do estágio larval L1 até o primeiro dia da idade adulta. Portanto, para realizar um experimento com 500.000 adultos, são necessárias 13 placas de alto crescimento: uma placa para gerar a população de L1s, duas placas para gerar os adultos para branqueamento, e 10 placas para o crescimento dos animais experimentais. Essas métricas são condicionadas às condições de semeação e crescimento bacteriano das placas de alto crescimento. Por isso, recomenda-se fazer todas as placas de forma padronizada e, em seguida, calibrar com quantidades conhecidas de animais.
Os vermes são contados em duas etapas durante o processo de cultivo: 1) antes de semear vermes em placas e 2) antes de gerar a mídia condicionada. A densidade do cultivo animal tem sido demonstrada para impactar o comportamento, o desenvolvimento e as respostas ao estresse15,,16,17,18 e pode, portanto, influenciar também as cargas ev. Portanto, para uma densidade de cultivo consistente é necessário estimar com precisão as populações de vermes. Quantificar o número de vermes em nove gotas dá confiança estatística das estimativas populacionais. É essencial tratar cada gota individualmente, vórticando entre cada gota e inserindo a pipeta a mesma distância na suspensão do verme. Tomar essas precauções garantirá valores s.e.m. de ~5-10% da população total. Se o S.E.M. para uma população de vermes é maior que 20%, então algo deu errado.
Após o período de incubação sem bactérias de 24 h, jovens, selvagens tipo C. elegans rastejam imediatamente após a adição a um gramado bacteriano. Isso indica que a incubação não afeta severamente sua saúde. No entanto, essa etapa influencia a fisiologia dos animais e, portanto, pode influenciar a composição das cargas EV. Portanto, ao trabalhar com genótipos muito doentes ou animais mais velhos, é essencial verificar a viabilidade após a etapa de incubação. Se todos os animais não sobreviverem à incubação, então aumente o tamanho da população experimental e diminua o tempo de incubação. Ao trabalhar com grandes volumes de mídia condicionada, é mais prático usar um concentrador de células agitadas com um filtro feito de nitrocelulose regenerada. Os EVs não se ligam a esta química do filtro tão fortemente quanto outros tipos defiltro14.
A proporção da proteína total recuperada da mídia condicionada ao número de animais incubados para fazer a preparação é uma métrica útil. Se essa proporção for muito maior do que o esperado, então é possível que as estimativas populacionais estavam desligadas ou que os animais morreram e se deterioraram na mídia condicionada. Se essa razão for muito menor do que o esperado, então alguma proteína pode ter sido perdida nos filtros durante o processo de concentração. Embora os métodos FACS quantifiquem diretamente os EVs na preparação, essa métrica é útil porque pode destacar anomalias amostrais no início do processo. Outro método útil para verificar a qualidade da preparação do EV é a microscopia eletrônica de transmissão, conforme mostrado na Figura 4D. Embora o protocolo de microscopia eletrônica de transmissão não esteja formalmente incluído neste artigo de métodos devido ao comprimento, ele pode ser conduzido por métodos padrão. Recomenda-se realizar esse tipo de análise, pelo menos inicialmente, como um método complementar ao FACS para avaliar a qualidade das preparações de EV. Para obter melhores resultados, utilize grades formvar-carbono recém-descarregadas e manche as amostras com ácido fosfotungstic de 2% em vez de acetato de uranyl.
O DI-8-ANEPPS foi escolhido porque foi demonstrado para rotular quantitativamente as membranas EV, superando outros corantes ev gerais com amostras de biópsia humana e liposódeiros25. As medidas são rápidas, levando apenas 3 minutos de tempo de coleta para cada amostra. A quantificação de EVs sensíveis ao detergente tem significância funcional direta porque capitaliza uma distinção física fundamental entre EVs e agregados de lipoproteínas sólidas. É importante ressaltar que este método não é influenciado pela quantidade total de proteínas ou número de agregados não-EV e, portanto, pode quantificar Os EVs obtidos através de diferentes métodos de purificação de forma imparcial. A métrica de EV verificada pelo FACS que descrevemos aqui seria especialmente útil para estudos que demonstram impactos fisiológicos de EVs purificados. Também poderia beneficiar o campo ev em geral para estabelecer uma metodologia FACS como uma métrica universal para que as abundâncias absolutas de EV possam ser diretamente comparadas entre os estudos. Corantes vitais também podem rotular EVs C. elegans, mas eles não são tão brilhantes quanto os EVs rotulados com Di-8-ANEPPS.
Esta abordagem de purificação capitaliza a secreção ativa de EVs fora dos corpos de vermes vivos intactos. Isso permite que os EVs C. elegans sejam isolados em pureza e abundância comparáveis a partir da cultura celular, especificações suficientes para identificar centenas de cargas de proteína e RNA via lc-MS-MS e análise RNAseq26. Assim, a grande biblioteca de reagentes disponíveis para a pesquisa de C. elegans pode ser aproveitada para investigar a influência da perturbação genética e fisiológica na composição da carga EV.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos com gratidão Nick Terzopoulos por placas de vermes e reagentes; o Centro de Genética caenorhabditis (CGC) do NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) para a linha n2 nematode; Lucia Vojtech, PhD, para assistência na análise de rastreamento de nanopartículas; Jessica Young, PhD, e Marie Claire, MD, PhD, para mídia celular climatizada de hiPSC; Wai Pang para assistência com imagens TEM. Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do NIH P30AG013280 à MK e ao NIH grant AG054098 à JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |