Здесь мы представляем протокол к удалять генетически помечены субпопуляция нейронов лазером двух фотонов от данио рерио личинки.
Чтобы определить роль субпопуляции нейронов в поведении, важно проверить последствия блокирования свою деятельность на живых животных. Лазерная абляция нейронов является эффективным методом для этой цели, когда нейроны выборочно помечены флуоресцентных зондов. В настоящем исследовании протоколы для лазерной абляции субпопуляции нейронов под микроскопом двух фотонов и тестирования его функциональные и поведенческие последствия описаны. В этом исследовании поведение захвата добычи в zebrafish личинки используется как модель исследования. Pretecto гипоталамический цепи известно, лежат в основе этой визуально инициативе добычу поведение ловля. Данио рерио метаталамус были удаленной лазера, и активность нейронов в нижней доле гипоталамуса (ILH; целевой pretectal проекции) был рассмотрен. Также был испытан поведение захвата добычу после pretectal абляции.
Чтобы понять, как поведение возникает от активности нейронов в головном мозге, необходимо определить нейронных цепей, которые участвуют в генерации этого поведения. В личиночной стадии, данио рерио обеспечивает идеальная модель животных для изучения функции мозга связанные с поведением, потому что их небольшой, прозрачной мозги позволяют исследовать нейронной активности в клеточном резолюции в широкой области мозг при соблюдении поведения1. Визуализация активности нейронов в конкретных нейронах стало возможным благодаря изобретение показателей (GECIs) генетически закодированный кальция (Ca), например GCaMP2. GCaMP трансгенных данио рерио оказались полезными для сопоставления функциональных нейронные цепи с поведением путем проведения Ca изображений в себя животных3.
В то время как Ca изображений можно продемонстрировать корреляции между нейронной активности и поведение, чтобы показать причинности, подавление активности нейронов и тестирования его consequence(s) на поведение являются важными шагами. Существуют различные способы для достижения этой цели: использование генетической мутации, которая изменяет конкретные нейронных цепей4, выражение нейротоксинов в конкретных нейронах5,6, использования optogenetic инструментов, таких как галородопсин7, и Лазерная абляция целевых нейронов8,9. Лазерная абляция особенно подходит для ликвидации деятельность в сравнительно небольшое число конкретных нейронов. Необратимой ликвидации нейронной активности, убивая нейронов облегчает оценки поведенческих последствий.
Один из интересных поведение, которое можно наблюдать в личиночной стадии в данио рерио — добычу захвата (рис. 1A). Это визуально гидом, целенаправленное поведение обеспечивает благоприятный экспериментальная система для изучения остроты10, зрительномоторной преобразование11,12,13, визуальное восприятие и признание объекты14,,1516,17,18и принятия решений19. Как хищные признается хищников и как добычу обнаружения ведет добычу ловить поведение был центральным вопросом в Нейроэтология20. В этой статье, мы сосредоточить внимание на роли pretecto гипоталамический контура, образованного прогнозы ядра в метаталамус (ядро pretectalis superficialis Парс magnocellularis, далее, просто к сведению как метаталамус) в ILH. Лазерная абляция метаталамус было показано сократить добычу захвата активности и упразднить нейронной активности в ILH, который связан с добычей визуального восприятия21. Здесь протоколы для выполнения лазерной абляции и тестирования его эффект с помощью Ca2 + изображений и поведенческих запись в данио рерио, личинки описаны.
Хотя два фотона лазерного имеет отличное пространственное разрешение для специально удалять отдельных нейронов, большой осторожностью следует во избежание нежелательных повреждений на ткани мозга из-за тепла. Наиболее важным шагом в эксперименте уноса необходимо определить оптимал…
The authors have nothing to disclose.
Эти исследования финансировались грантов, полученных от МПКСНТ, JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP25290009, JP25650120, JP17K07494 и JP17H05984.
NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
SZX7 | Olympus | stereoscope | |
DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |