概要

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

Published: June 02, 2018
doi:

概要

Qui, presentiamo un protocollo per l’ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Abstract

Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L’ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l’ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l’attività neuronale nel lobo inferiore dell’ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.

Introduction

Per capire come comportamento nasce dall’attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l’attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento1. La formazione immagine dell’attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l’invenzione di indicatori codificato geneticamente calcio (Ca) (GECIs) come GCaMP2. Zebrafish transgenici GCaMP hanno dimostrato di essere utile per l’associazione funzionale circuito neurale con comportamento conducendo imaging Ca a comportarsi animali3.

Mentre la formazione immagine Ca può dimostrare correlazioni tra attività neuronale e comportamento, per mostrare la causalità, soppressione dell’attività neuronale e prova la sua consequence(s) il comportamento sono passi importanti. Ci sono vari modi per raggiungere questo obiettivo: utilizzare di mutazione genetica che altera i circuiti neurali specifici4, espressione delle neurotossine in neuroni specifici5,6, uso di strumenti di optogenetica come halorhodopsin7, e ablazione di neuroni mirate8,9laser. L’ablazione laser è particolarmente adatta per l’eliminazione di attività in un numero relativamente piccolo di neuroni specifici. Eliminazione irreversibile dell’attività neuronale uccidendo i neuroni facilita la valutazione comportamentale conseguenze.

Un comportamento interessante che può essere osservato nella fase larvale in zebrafish è la cattura di prede (Figura 1A). Questo comportamento visivamente guidato, obiettivo-diretto fornisce un favorevole sistema sperimentale per lo studio della acuità visiva10, trasformazione visuomotoria11,12,13, percezione visiva e riconoscimento della oggetti14,15,16,17,18e il processo decisionale19. Come preda è riconosciuto dai predatori e come preda rilevamento conduce alla preda cattura comportamento è stato una questione centrale in neuroethology20. In questa carta, ci concentriamo sul ruolo del circuito pretecto-ipotalamica formato da proiezioni di un nucleo nel pretetto (nucleo pretectalis superficialis pars magnicellulare, d’ora in avanti, semplicemente notato come il pretetto) per il ILH. Ablazione laser del Pretetto è stato indicato per ridurre l’attività di cattura di prede e abolire l’attività neuronale in ILH che è associato con la percezione visiva preda21. Qui, protocolli per l’esecuzione di laser ablazione e prova il suo effetto utilizzando Ca2 + imaging e registrazione del comportamento in zebrafish larve sono descritti.

Protocol

1. ablazione di una sottopopolazione di neuroni usando un microscopio a due fotoni Laser Nota: Se gli utenti intenzione di eseguire l’ablazione seguente imaging Ca, utilizzare il UAShspzGCaMP6s linea21. Se gli utenti intenzione di eseguire la registrazione del comportamento dopo ablazione, utilizzare la riga di UAS:EGFP, come l’ablazione delle cellule EGFP-positive è più facile da eseguire rispetto delle cellule che esprimono GCaMP6s. Inizia…

Representative Results

Neuroni specifici geneticamente sono stati etichettati con EGFP o GCaMP6s, la cui espressione sono stati guidati in Gal4 linee. Un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 è stato utilizzato per etichettare un nucleo nella zona pretectal (magnocellulare nucleo pretectal superficiale) e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. Un’altra linea di Gal4, hspGFFDMC76A, è stata usata per etichettare il ILH. Abbiamo laser-ha rimosso i neuroni pretectal bilateralmente (Figura…

Discussion

Anche se il laser del due-fotone ha un’ottima risoluzione spaziale per specificamente l’ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell’esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di i…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questi studi sono stati finanziati da contributi ricevuti dal MEXT, JSPS KAKENHI Grant numeri JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.

Materials

NuSieve GTG Agarose Lonza Cat.#50080 low-melting temperature agarose
6 cm petri dish FALCON Product#:351007
dissecting needle AS ONE Corporation Cat. No. 2-013-01 https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP Carl Zeiss two-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0 Carl Zeiss 63X objective lens
Imager.Z1 Carl Zeiss an epi-fluorescence microscope
ZEN Carl Zeiss Image acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 Used as a behavioral recording chamber
surgical knife MANI Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics model:C11440-22CU a scientific CMOS camera
HCImage Hamamatsu Photonics image acuisition software
Hard Disk Recording module Hamamatsu Photonics An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7 Olympus stereoscope
DF PL 0.5X Olympus objective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio FLIR Systems, Inc. Product No. GS3-U3-41C6NIR-C CMOS camera
XIMEA xiQ camera XIMEA Product No. MQ042RG-CM CMOS camera
a ring LED light CCS Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Nylon mesh 32µm Tokyo Screen N-No.380T http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µm Tokyo Screen N-No. 508T-K http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. dry beer yeast
LabVIEW National Instruments an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP Spectra Physics  two-photon laser 

参考文献

  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. 神経科学. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
  24. . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  27. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
  28. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

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記事を引用
Muto, A., Kawakami, K. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57485, doi:10.3791/57485 (2018).

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