כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.
כדי לזהות את התפקיד של subpopulation של נוירונים בהתנהגות, זה חיוני כדי לבדוק את ההשלכות של חסימת פעילותו בבעלי חיים. אבלציה לייזר של נוירונים היא שיטה יעילה למטרה זו כאשר נוירונים מסומנות באופן סלקטיבי עם הגששים פלורסנט. במחקר הנוכחי, מתוארים פרוטוקולי לייזר ablating של subpopulation של הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ובדיקות של השלכותיה פונקציונלי והתנהגותיים. במחקר זה, התנהגות לכידת הטרף דג זברה הזחלים משמש כמודל המחקר. המעגל pretecto-היפותלמי ידוע מונחת ביסוד זה טרף מונחה באופן חזותי לתפוס התנהגות. דג זברה pretectum היו ablated לייזר, נבחנה פעילות. עצבית באונה נחות של ההיפותלמוס (ILH; היעד של התחזית pretectal). התנהגות לכידת הטרף לאחר אבלציה pretectal נבחנה גם.
כדי להבין איך התנהגות נובעת פעילות. עצבית במוח, יש צורך לזהות את המעגלים העצביים המעורבים הדור של התנהגות זו. בשלב הזחל, מספק דג זברה במודל חיה אידיאלית עבור לומדים של תפקוד המוח הקשורים להתנהגות כי המוח שלהם קטן, שקופים מאפשרים לחקור פעילות. עצבית ברזולוציה הסלולר באזור רחב של המוח תוך כדי התבוננות של התנהגות1. הדמיה של פעילות. עצבית בנוירונים מסוים הפך אפשרי דרך ההמצאה של אינדיקטורים מקודדים גנטית סידן (Ca) (GECIs) כגון GCaMP2. דג זברה מהונדס GCaMP הוכיחו להיות שימושי עבור שיוך המעגל עצבית תפקודית התנהגות על-ידי עריכת Ca הדמיה ב מתנהג בעלי חיים3.
בעוד דימות Ca יכולים להדגים מתאמים בין פעילות. עצבית והתנהגות, להראות סיבתיות, דיכוי פעילות. עצבית ובדיקה שלו consequence(s) על התנהגות הם צעדים חשובים. ישנן מספר דרכים להשיג זאת: שימוש מוטציה גנטית שמשנה את המעגלים העצביים ספציפי4, ביטוי של רעלנים עצביים ב-5,נוירונים ספציפיים6, שימוש בכלים optogenetic כגון halorhodopsin7, ו לייזר אבלציה של נוירונים יישוב8,9. אבלציה לייזר מתאים במיוחד עבור ביטול פעילות במספר קטן יחסית של נוירונים ספציפיים. חיסול בלתי הפיך של פעילות. עצבית על ידי הריגת נוירונים מקלה על הערכת השלכות התנהגותיות.
התנהגות מעניין אחד זה יכול להיות שנצפו בשלב הזחל בתוך דג זברה היא ללכוד את הטרף (איור 1א’). התנהגות זו מונחה באופן חזותי, מכוון מטרה מספק מערכת ניסויית רייטינג לצורך המחקר של זיהוי של התפיסה החזותית, טרנספורמציה visuomotor11,12,13, חדות הראייה10 אובייקטים14,15,16,17,18, קבלת החלטות19. איך טרף מזוהה על ידי טורפים, כיצד זיהוי הטרף מוביל טרף לתפוס התנהגות כבר בשאלה מרכזית neuroethology20. בנייר זה, אנו מתמקדים התפקיד של המעגל pretecto-היפותלמי הנוצרת על-ידי הקרנות של גרעין ב pretectum (גרעין pretectalis השטחי pars magnocellularis, בעתיד, פשוט ציינו גם pretectum) כדי ILH. לייזר-אבלציה של pretectum הוצגה להפחית את פעילות ללכוד טרף, לבטל את הפעילות העצבית ILH המשויך תפיסה חזותית טרף21. כאן, פרוטוקולים לביצוע לייזר השפעתו באמצעות Ca2 + הדמיה והקלטה התנהגותית דג זברה הזחלים מתוארים אבלציה ובדיקות.
למרות שני הפוטונים הלייזר יש רזולוציה מרחבית מעולה כדי במיוחד ablate נוירונים בודדים, נהדר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה על רקמת המוח עקב חום. הצעד החשוב ביותר לניסוי אבלציה היא לקבוע את כמות לייזר הקרנה אופטימלית. הקרנה לא מספיקות נכשלת להרוג את הנוירונים. הקרנה מדי יהיה חום-פגיעה…
The authors have nothing to disclose.
מחקרים אלה, במימון מענקים שהתקבלו מן MEXT, JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP25290009, JP25650120, JP17K07494, JP17H05984.
NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
SZX7 | Olympus | stereoscope | |
DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |