En este trabajo se describe un procedimiento optimizado para la extracción y el análisis de las prostaglandinas y otros eicosanoides de<em> C. elegans</em> Usando LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans se está convirtiendo en un modelo animal de gran alcance para estudiar la biología de los lípidos de 1-9. Las prostaglandinas son una clase importante de los eicosanoides, que son señales de lípidos derivados a partir de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) 10-14. Estas moléculas de señalización son difíciles de estudiar debido a su baja abundancia y la naturaleza reactiva. El rasgo característico de las prostaglandinas es una estructura de anillo de ciclopentano situado dentro de la estructura de ácido graso. En los mamíferos, las prostaglandinas se pueden formar a través de la ciclooxigenasa enzima dependiente de las vías independientes-y 10,15. C. elegans sintetiza una amplia gama de prostaglandinas independientes de las ciclooxigenasas 6,16,17. Una gran clase de prostaglandinas de la serie F ha sido identificado, pero el estudio de los eicosanoides se encuentra en una fase temprana, con un amplio espacio para nuevos descubrimientos. Aquí se describe un procedimiento para la extracción y el análisis de las prostaglandinas y otros eicosanoides. Lípido cargados se extraen a partir de cultivos de gusano de masas utilizando una técnica de extracción líquido-líquido y se analizaron por cromatografía líquida acoplada a la ionización por electrospray y espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS/MS). La inclusión de análogos deuterados de prostaglandinas, tales como PGF 2 α-d 4 como se recomienda un patrón interno para el análisis cuantitativo. Control de la reacción múltiple o MRM se pueden utilizar para cuantificar y comparar los tipos de prostaglandinas específicas entre los animales de tipo salvaje y mutante. Descomposición inducida por colisión o MS / MS se pueden utilizar para obtener información sobre características estructurales importantes. La cromatografía líquida espectrometría de masas (LC-MS) rastreos de reconocimiento de un rango de masas seleccionado, tales como m / z 315 a 360 se puede utilizar para evaluar los cambios globales en los niveles de prostaglandina. Proporcionamos ejemplos de los tres análisis. Estos métodos proporcionan a los investigadores un conjunto de herramientas para el descubrimiento de nuevos eicosanoides y delinear sus vías metabólicas.
Las prostaglandinas (PGs) son una clase importante de hormonas de lípidos que se han investigado e implicado en la regulación de la reproducción, la inmunidad, y el desarrollo en una amplia gama de organismos 12-14 ampliamente. PGs son ideales para sistemas completos análisis de biología, ya que comprenden una serie de lípidos derivados de un precursor común (s). El nematodo C. elegans es uno de los organismos modelo más utilizado para abordar las cuestiones fundamentales de la genética y la biología de sistemas.
Hemos demostrado que C. elegans sintetiza PGs de la serie F que guían espermatozoides móviles de los ovocitos 3,6,16. PGs de la serie F derivadas de PUFA de 20 carbonos con tres, cuatro, y cinco dobles enlaces, que comprende la F1, F2, F3 y clases, respectivamente, se han identificado 3,16. Estos PGs se sintetizan independiente de las enzimas ciclooxigenasa, sin embargo, estereoisómeros PGF 2α 1α y PGF son todavía GEnerated. Para los análisis cualitativos y cuantitativos de C. elegans PGs, LC-MS/MS es un potente y sensible técnica analítica. Antes de realizar este análisis, es importante desarrollar un método de extracción optimizado debido a que el rendimiento del proceso analítico depende en gran medida de la calidad del extracto. La cromatografía líquida y espectrometría de masas sólo pueden proporcionar masa anticipado a carga (m / z), así como la forma de pico deseable y tiempo de retención del ion primario PG. Perfiles metabólicos de las PGs en C. elegans es una tarea difícil que requiere diferentes estrategias de adquisición de MS.
Escaneo o exploración completa encuesta CL-EM (Q1 escaneado) tiene la ventaja de asegurar que las PGs más ionizables generarán una respuesta de espectrometría de masas. Si bien la exploración encuesta proporciona información útil en el perfil total de PGs en relación con el de tipo salvaje y mutante C. elegans, la detección de PGs menores se ve comprometida debido a la baja sensibilidad. Neverthemenos, escaneo CL-EM encuesta puede dar una visión global de las PGs y es particularmente útil para el análisis de mutantes predichos para afectar el metabolismo de una población PG grande.
En la identificación de metabolitos, el análisis LC-MS/MS de normas PG síntesis química se lleva a cabo primero para obtener su espectro de iones producto como compuestos de referencia. Estos espectros se puede comparar con el espectro de un metabolito desconocido. El modo de monitorización de reacción múltiple (MRM) se usa para mejorar la sensibilidad y la especificidad. Un experimento MRM se lleva a cabo mediante la especificación de la de iones / iones de producto padre transición masa de un compuesto. Al conocer la masa y la estructura de los analitos diana, es posible predecir transiciones de MRM teóricos para muchos metabolitos desconocidos.
Un método LC-MS/MS optimizado para perfilar PGs isómeros en C. No se ha informado elegans. A continuación se describe la extracción y el enfoque integrado de espectrometría de masas consiste en LC-MS y LC-MS / MS métodos para detectar, cuantificar, y la investigación de C. elegans metabolitos PG. Este enfoque se puede aplicar a otros eicosanoides.
Se describe un procedimiento para la extracción y el análisis de los eicosanoides, centrándose en PGs de la serie F. Hay varias partes del procedimiento que puede ser problemático. En primer lugar, es fundamental que los cultivos de gusanos no mueren de hambre, como el hambre puede alterar el metabolismo PG. Para la alimentación complementaria, se recomienda NA22 bacterias en lugar de los OP50 bacterias más comúnmente utilizadas por NA22 alcanza una mayor densidad. Sin embargo, la cepa NA22 carece de resistencia a los antibióticos y es más susceptible a la contaminación. En segundo lugar, los gusanos sintetizar isómeros PG individuales en abundancia bajo en relación con los tejidos de mamíferos. Esto puede ser debido, en parte, a la redundancia entre los numerosos isómeros. Recomendamos unos 6 g de tejido para análisis completo y señales más fuertes. Menos tejido (1-2 g) se puede utilizar si el extracto seco se resuspendió en menos metanol: solución de agua para aumentar la concentración de PG. Sin embargo, se pueden realizar sólo una o dos inyecciones. El límite de detección de nuestro sistema de LC-MS/MS es de aproximadamente 10 pgPGF 2α / ml. Un ml de densas gusanos etapa mixta (aproximadamente 1 g) se obtiene más o menos 25-50 pg de CePGF2. Sistemas de espectrometría de masas más sensibles pueden reducir la cantidad de tejido necesario para el análisis del gusano. En tercer lugar, las diferencias en la eficiencia de extracción PG entre las muestras pueden provocar resultados variables. Hemos encontrado que la eficiencia de extracción es muy similar cuando los tejidos se extraen en paralelo. Para determinar la eficiencia, añadir 1,0 ng de PGF 2α-d 4 en la etapa de homogeneización como un control interno. MRM con la transición de masa m / z 357/197 se utiliza para medir la concentración de PGF 2α-d4 relación a un 1 ng / ml solución estándar. Luego se calcula el importe de PGF 2α-d4 perdido durante la extracción.
Los parámetros de cromatografía y transiciones de masa que incluimos pueden ser alterados para detectar otras PGs y eicosanoides. A pesar de considerables esfuerzos, no hemos sido capaces de identificar la serie D o E-sers PGs en los extractos 17. Por otra parte, no hemos detectado 8-iso PGF 2α y 8-iso PGE2 que son característicos de la libre peroxidación iniciada por radicales, que genera una mezcla selectiva de PG estereoisómeros 19. Ya sea que los gusanos sintetizan otros tipos PG no se conoce. Los endocannabinoides y diversos epoxi e hidroxi metabolitos de los ácidos araquidónico y eicosapentaenoico se han encontrado en C. elegans extrae 5,7,20,21. Se recomienda el uso de ambos MRM y MS / MS en comparación con patrones auténticos para la cuantificación e identificación, respectivamente. Para nuevos eicosanoides, estos análisis se deben combinar con un estudio comparativo de los mutantes de grasa, que son deficientes en la síntesis de PUFA enzimas 22, así como un ensayo funcional, si es posible. Una advertencia para el análisis de mutantes de grasa es que pequeñas cantidades de PUFAs presentes en los gusanos son suficientes para la síntesis de PG. Por ejemplo, la grasa-2 (wa17) mutantestener una pequeña cantidad de la actividad desaturasa D12 (~ 5% de tipo salvaje 22) y estos mutantes todavía producen PGs 6. grasa-3 (WA22) y grasa-4 (WA14) mutantes no pueden sintetizar las PGs derivadas de los ácidos araquidónico y eicosapentaenoico 16 . También hemos encontrado que los mutantes de grasa para compensar la pérdida de clases por AGPI hasta la regulación de la síntesis de PG de las clases restantes. Por ejemplo, grasa-3 (WA22) mutantes no pueden sintetizar la mayoría de las PGs derivadas de PUFA 20-carbono. En cambio, parece que hasta de regular PGs nuevos derivados de 18 carbonos PUFAs 16. Hasta la fecha, no hemos identificado una C. elegans cepa que es completamente deficiente en la síntesis de PG. Es posible que las PGs son esenciales para el crecimiento o el desarrollo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los metabolómica dirigida UAB y Laboratorio de Proteómica, que ha sido apoyado en parte por el Centro de Investigación de Enfermedades UAB Skin (P30 AR050948 Elmets a C.), el Centro de Lesiones de O'Brien Renal Aguda UAB-UCSD (P30 DK079337 a A. Agarwal ) y el Centro de Salud Pulmonar UAB (HL114439 R01, R01 HL110950 de JE Blalock). Soporte para el espectrómetro de masas era de una subvención compartida Instrumentación CNRR (S10 RR19261 de S. Barnes). También queremos agradecer a Ray Moore para soporte técnico. C. elegans cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por el NIH. Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01GM085105 al MAM, incluyendo un suplemento administrativa ARRA).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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