本稿では、プロスタグランジンや他のエイコサノイドからを抽出し、分析するために最適化された手順を説明<em> C.エレガンス</em> LC-MS/MSを用いた。
線虫(Caenorhabditis elegans)は、脂質1-9の生物学を研究するための強力な動物モデルとして浮上している。プロスタグランジンは、多価不飽和脂肪酸(PUFAは)10-14由来脂質信号でエイコサノイドの重要なクラスである。これらのシグナル伝達分子が低いため豊かさと反応性の性質を研究することは困難である。プロスタグランジンの特徴は、脂肪酸の主鎖内に位置するシクロペンタン環構造である。哺乳類では、プロスタグランジンは、シクロオキシゲナーゼ酵素依存性および非依存性経路10,15を貫通して形成することができる。℃でエレガンスは、シクロオキシゲナーゼ6,16,17の独立したプロスタグランジンの広い配列を合成する。 Fシリーズのプロスタグランジンの大きなクラスは識別が、エイコサノイドの研究は、新しい発見の余地と早い段階にありました。ここでは、プロスタグランジンおよび他のエイコサノイドを抽出して分析するための手順を説明します。荷電脂質sが液 – 液抽出法を用いた質量ワーム培養物から抽出し、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)に結合液体クロマトグラフィーによって分析する。内部標準などPGF 2のようなプロスタグランジン、α-D 4の重水素化類似体の包含は定量分析のために推奨されます。多重反応モニタリング又はMRMは、野生型および変異動物との間に特定のプロスタグランジンの種類を定量化して比較するために使用することができる。衝突誘起分解又はMS / MSは、重要な構造的特徴に関する情報を得ることができる。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)は、 のm / z 315から360として選択された質量範囲の調査スキャンは、プロスタグランジンレベルのグローバル変化を評価するために使用することができる。我々はすべての3つの分析の例を示します。これらのメソッドは、新規エイコサノイドを発見し、その代謝経路の輪郭を描くためのツールセットを研究者に提供します。
プロスタグランジン(PG類)は広く生物12-14の広い配列に再生、免疫、および開発の調節に調査し、関与している脂質ホルモンの重要なクラスである。彼らは共通の前駆体(S)から派生した脂質のシリーズを構成するためのPGは、理想的には包括的なシステム生物学の分析に適しています。線虫C.エレガンスは、遺伝学とシステム生物学の基本的な質問に対処するために最も広く使用されているモデル生物の一つである。
私たちは、実証されていることでエレガンスは、FシリーズのPG類を合成し、その卵母細胞3,6,16に精子ガイド。それぞれ3つ、4つ、5つの二重結合を含むF1、F2、およびF3クラスで20個のPUFAの由来のFシリーズのPGは、3,16同定されている。これらのPGは、シクロオキシゲナーゼ酵素の独立した合成、まだPGF1αとPGF2α立体異性体はまだGEあるさnerated。 Cの定性·定量分析のためのelegansの PGは、LC-MS/MSは、強力で高感度な分析手法である。この分析を実行する前に、分析プロセスの性能が大きくエキス品質に依存するため、最適化された抽出方法を開発することが重要である。液体クロマトグラフィーおよび質量分析は、比(m / z)を充電するために予想される質量、ならびにPG親イオンの望ましいピーク形状および保持時間を提供することができる。 CのPG類の代謝プロファイリングエレガンスは、様々なMSの買収戦略を必要とする困難な作業である。
LC-MSフルスキャンまたはアンケート走査(スキャンQ1)は、ほとんどのイオン化質量分析のPGは、応答を生成する保証するという利点を有する。サーベイスキャンは、野生型と変異型C.に関してのPG合計プロファイリングに関する有用な情報を提供していますがエレガンス 、マイナーPG類の検出は低感度のために危険にさらされます。いえ、以下、LC-MS調査走査のPGの全体像を与え、大きなPG集団の代謝に影響を及ぼすことが予想変異を分析するために特に有用であることができる。
代謝物の同定においては、化学的に合成された規格のPG LC-MS/MS分析は、最初の参照化合物としてのプロダクトイオンスペクトルを得るために行われる。これらのスペクトルは、未知の代謝物のスペクトルと比較することができる。多重反応モニタリング(MRM)モードが強化された感度および特異性のために使用される。 MRM実験は、化合物の親イオン/プロダクトイオン質量遷移を指定することによって達成される。標的分析物の質量と構造を知ることによって、それは多くの未知の代謝物の理論MRM遷移を予測することが可能である。
Cの異性体のPGをプロファイリングするための最適化されたLC-MS/MS法線虫は報告されていない。ここでは、LC-MSとからなる抽出および統合された質量分析アプローチを説明して、LC検出、定量化、 およびCを調査するためのMS / MSメソッドelegansの PG代謝物。このアプローチは、他のエイコサノイドに適用することができる。
私たちは、FシリーズPGのに焦点を当て、エイコサノイド抽出および分析のための手順を説明します。問題となる可能性がある手順のいくつかの部分があります。まず最初に、それは飢餓がPG代謝を変えることができますようにワームの文化が、餓死しないことが重要です。 NA22は、より高い密度に達したので、補足的な給餌の場合、NA22細菌がより一般的に使用さOP50細菌の代わりに推奨されています。しかし、NA22株は抗生物質耐性を欠き、汚染を受けやすい。第二に、ワームは、哺乳動物の組織に比べて低濃度では、個々のPG異性体を合成する。これは部分的に、多数の異性間の冗長性に起因することがあります。我々は包括的な分析と強い信号のための組織の約6グラムをお勧めします。 PG濃度を増加させる水溶液:乾燥した抽出物を減らすメタノール中に再懸濁されている場合より少ない組織(1-2 g)を用いることができる。しかし、1〜2回の注射を行うことができる。我々のLC-MS/MS系の検出限界は10 pgの程度であるPGF2α/ mlの。密集混在ステージワームの一つミリリットル(約1g)がCePGF2の約25-50 pgのが得られます。より高感度な質量分析システムは、分析に必要なウォーム組織の量を低減することができる。第三に、サンプル間のPG抽出効率の違いは、変数の結果を引き起こす可能性があります。我々は、組織を並列に抽出する際の抽出効率は非常に類似していることを見出した。効率性を判断するには、内部統制などの均質化工程でPGF2α-D 4の1.0 ngのを追加します。質量遷移のm / z 197分の357を使用して、MRMは1 ngの/ mlの標準溶液に対してPGF2α-d4の濃度を測定するために使用される。抽出中に失われたPGF2α-dの4の量を算出する。
我々が含むクロマトグラフィパラメータおよび質量遷移は、他のPGとエイコサノイドを検出するように変更することができる。かなりの努力にもかかわらず、我々は、D-シリーズまたはE-SERを識別することができていないIESは抽出17 PGS。さらに、我々はPG立体異性体19の非選択的な混合物を生成し、フリーラジカル開始過酸化、の特徴である8 -イソPGF2αと8 -イソPGE 2を検出していない。ワームは、他のPG型を合成するかどうかは不明である。カンナビノイドとアラキドンとエイコサペンタエン酸の様々なエポキシ樹脂とヒドロキシ代謝物はCで発見されている虫は 5,7,20,21を抽出します。我々はそれぞれ、定量と同定のための本格的な標準規格に比べMRMとMS / MSの両方の使用をお勧めします。小説エイコサノイドの場合は、これらの分析が可能であれば、PUFA合成酵素22と同様に、機能アッセイに欠損している変異体脂肪の比較研究と組み合わせる必要がある。 脂肪変異体を分析する注意点は、ワームに存在するPUFAの微量はPG合成のために十分であるということです。例えば、 脂肪-2(wa17)変異体D12デサチュラーゼ活性を少量(野生型22〜5%)があり、これらの変異体は、まだPGの6を生成する。 脂肪-3(WA22)と脂肪-4(WA14)変異体はアラキドン由来のPGとエイコサペンタエン酸16を合成するために失敗する。我々はまた、 脂肪変異体が残りのクラスからアップレギュレートPG合成によるPUFAクラスの損失を補償することを見出した。例えば、 脂肪3(WA22)変異体は、20 -炭素のPUFA由来最もPG類を合成するために失敗する。代わりに、彼らは、18 -炭素PUFAは16由来の新規のPG類をアップレギュレートするように見える。これまでに、我々はCを確認されていませんPG合成を完全に欠損しているエレガンス株 。また、PGは、成長や開発に必須であることが可能である。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、UAB皮膚病研究センター(C. ElmetsへP30 AR050948)、A. AgarwalさんにUAB-UCSDオブライエン急性腎傷害センター(P30 DK079337によって部分的にサポートされていUAB標的メタボロミクスとプロテオミクスラボラトリーに感謝)とUAB肺保健センター(JEブラロックにR01 HL114439、R01 HL110950)。質量分析計のサポートはNCRR共有装助成(S.バーンズにS10 RR19261)からだった。また、テクニカル·サポートのためにレイ·ムーアに感謝します。C.虫株はNIHによって資金を供給される線虫の遺伝学センターによって提供された。この作品は、NIH(ARRA行政サプリメント含むR01GM085105にMAM)によってサポートされていました。
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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