In diesem Beitrag beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Extraktion und Analyse Prostaglandine und andere Eicosanoide aus<em> C. elegans</em> Mittels LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans ist als leistungsfähiges Tiermodell, um die Biologie von Lipiden 1-9 studieren Schwellenländern. Prostaglandine sind eine wichtige Klasse der Eicosanoide, die Lipid-Signale von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) 10-14 abgeleitet sind. Diese Signalmoleküle sind aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und reaktive Natur zu studieren. Das charakteristische Merkmal der Prostaglandine ist ein Cyclopentanring Struktur innerhalb der Fettsäure Rückgrat entfernt. Bei Säugetieren können Prostaglandine durch Cyclooxygenase-Enzym-abhängige und-unabhängige Wege 10,15 gebildet werden. C. elegans synthetisiert eine breite Palette von Prostaglandinen unabhängig von Cyclooxygenasen 6,16,17. Eine große Klasse von F-Serie Prostaglandine identifiziert worden ist, aber die Studie der Eicosanoide ist in einem frühen Stadium mit reichlich Platz für neue Entdeckungen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Extraktion und Analyse Prostaglandine und andere Eicosanoide. Geladenen Lipids sind vom Massentourismus Wurm Kulturen mit einer Flüssig-Flüssig-Extraktion Technik extrahiert und durch Flüssigchromatographie gekoppelt mit Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). Die Einbeziehung der deuterierten Analoga der Prostaglandine, wie PGF 2 α-d 4 als ein interner Standard für die quantitative Analyse empfohlen. Multiple Reaction Monitoring oder MRM kann verwendet werden, um zu quantifizieren und vergleichen spezifische Prostaglandin-Typen zwischen Wildtyp und Mutante Tiere werden. Stoßfragmentierung oder MS / MS verwendet werden, um Informationen über wichtige strukturelle Merkmale zu erhalten. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Umfrage Scans eines ausgewählten Massenbereich wie m / z 315 bis 360 verwendet werden, um globale Änderungen in Prostaglandin Ebenen herangezogen werden. Wir stellen Beispiele für alle drei Analysen. Diese Methoden werden die Forscher mit einem Toolset für die Entdeckung neuartiger Eicosanoide und ihre Abgrenzung Stoffwechselwege zu stellen.
Prostaglandine (PGs) sind eine wichtige Klasse von Lipid-Hormone, die ausgiebig untersucht und beteiligt bei der Regulierung der Fortpflanzung, Immunität und Entwicklung in einem breiten Spektrum von Organismen 12-14. PGs sind ideal für eine umfassende Systembiologie Analysen geeignet, da sie eine Reihe von Lipiden aus einem gemeinsamen Vorläufer (s) abgeleitet sind. Der Fadenwurm C. elegans ist einer der am weitesten verbreitete Modell Organismen, um grundlegende Fragen der Genetik und Systembiologie anzugehen.
Wir haben gezeigt, dass C. elegans synthetisiert F-Serie PGs, die Führung zu beweglichen Spermien Eizellen 3,6,16. F-Serie PGs von 20-Kohlenstoff-PUFAs mit drei, vier und fünf Doppelbindungen, umfassend die F1, F2, F3 und Klassen, die jeweils abgeleitet wurden 3,16 identifiziert. Diese PGs synthetisiert werden unabhängig von Cyclooxygenase Enzyme, noch PGF 1α und PGF 2α Stereoisomere sind noch generated. Für die qualitative und quantitative Analysen von C. elegans PGs ist LC-MS/MS eine leistungsfähige und empfindliche analytische Technik. Vor der Durchführung dieser Analyse ist es wichtig, eine optimierte Extraktionsverfahren entwickelt, weil die Leistung des analytischen Prozesses hängt stark von der Qualität Extrakt. Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie können nur erwartet Masse-Verhältnis (m / z) berechnet, sowie wünschenswert Peakform und Verweilzeit des PG Stammion. Metabolic Profiling von PGs in C. elegans ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die verschiedenen MS Akquisitionsstrategien.
LC-MS Scan oder Scan-Umfrage (Q1-Scanning) hat den Vorteil, dass die meisten ionisierbare PGs eine massenspektrometrische Antwort zu generieren. Während die Umfrage Scan liefert nützliche Informationen über den Gesamtbetrag Profilierung PGs gegenüber Wildtyp und Mutante C. elegans, Erkennung von untergeordneter PGs ist aufgrund der geringen Empfindlichkeit beeinträchtigt. Dennochweniger kann LC-MS Umfrage Scannen geben einen globalen Überblick über PGs und ist besonders nützlich für die Analyse von Mutanten vorhergesagt Stoffwechsel eines großen PG Bevölkerung beeinträchtigen.
In Identifizierung von Metaboliten wird LC-MS/MS Analyse von chemisch synthetisierten PG Standards zuerst durchgeführt, um ihre Produkt-Ionen-Spektren als Referenz Verbindungen zu erhalten. Diese Spektren können zur Spektrum eines unbekannten Metaboliten verglichen werden. Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus wird für eine verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität verwendet. Ein MRM Experiment wird durch die Angabe der Stammion / Produkt Ionenmasse Übergang einer Verbindung durchgeführt. Durch die Kenntnis der Masse und Struktur der Zielanalyten, ist es möglich, theoretischen MRM Übergänge für viele unbekannte Metaboliten vorherzusagen.
Eine optimierte LC-MS/MS Methode zur Profilierung isomeren PGs in C. elegans wurde nicht berichtet. Hier beschreiben wir eine Extraktion und integrierte Massenspektrometrie Ansatz bestehend aus LC-MS und LC-MS / MS-Methoden zum Nachweis, zur Quantifizierung und Untersuchung C. elegans PG Metaboliten. Dieser Ansatz kann auch auf andere Eicosanoide angewendet werden.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Extraktion und Analyse Eicosanoid, mit Schwerpunkt auf F-Serie PGs. Es gibt mehrere Teile des Verfahrens, die problematisch sein kann. Erstens ist es wichtig, dass die Schnecke Kulturen nicht verhungern, als Hunger PG Stoffwechsel verändern können. Für Zufütterung werden NA22 Bakterien anstatt der häufiger verwendeten OP50 Bakterien weil NA22 erreicht höhere Dichte empfohlen. Allerdings mangelt es dem NA22 Stamm Antibiotikaresistenz und ist empfindlich gegen Verschmutzung. Zweitens synthetisieren Würmer individuelle PG Isomere in geringer Menge in Bezug auf Säugetiergeweben. Dies kann zum Teil auf Redundanz unter den zahlreichen Isomeren. Wir empfehlen ca. 6 Gramm Gewebe für eine umfassende Analyse und stärkere Signale. Weniger Gewebe (1-2 g) kann verwendet werden, wenn der getrocknete Extrakt in weniger Methanol resuspendiert werden: Wasser-Lösung in PG-Konzentration zu erhöhen. Jedoch kann nur ein bis zwei Injektionen durchgeführt werden. Die Nachweisgrenze der LC-MS/MS-System ca. 10 pgPGF 2α / ml. Ein ml von dicht gepackten gemischten Bühne Würmer (ca. 1 g) liefert etwa 25-50 pg CePGF2. Empfindlicher Massenspetrometriesysteme kann die Menge der Schnecke Gewebe zur Analyse. Drittens können Unterschiede in PG Extraktionseffizienz zwischen den Proben verursachen unterschiedliche Ergebnisse. Wir haben festgestellt, dass die Extraktion Effizienz sehr ähnlich, wenn Gewebe parallel extrahiert ist. Um die Effizienz zu bestimmen, fügen Sie 1,0 ng PGF 2α-d 4 auf der Stufe der Homogenisierung als interne Kontrolle. MRM mit Masse Übergang m / z 357/197 wird verwendet, um PGF 2α-d4 Konzentration relativ zu einer 1 ng / ml Standardlösung messen. Die Höhe der PGF 2α-d 4 während der Extraktion verloren wird dann berechnet.
Die Chromatographie Parameter und Masse Übergänge schließen wir können verändert werden, um anderen PGs und Eicosanoide detektieren. Trotz erheblicher Anstrengungen, haben wir nicht in der Lage, D-Serie oder E-ser identifizierenies PGs in den Extrakten 17. Darüber hinaus haben wir nicht 8-iso PGF 2α und 8-iso PGE 2, die charakteristisch für radikalisch initiierte Peroxidation, die eine Mischung von nicht-selektiven PG Stereoisomeren 19 erzeugt werden erkannt. Ob Würmer synthetisieren anderen PG-Typen ist nicht bekannt. Endocannabinoide und verschiedene Epoxy-und Hydroxy-Metaboliten von Arachidonsäure und Eicosapentaensäure Säuren in C. gefunden elegans extrahiert 5,7,20,21. Wir empfehlen die Verwendung von sowohl MRM und MS / MS im Vergleich zu authentischen Standards für die Quantifizierung und Identifizierung sind. Bei neuartigen Eicosanoide sollten diese Analysen mit einer vergleichenden Untersuchung von Fett-Mutanten, die einen Mangel an PUFA synthetisierende Enzyme 22, sowie einen funktionellen Assay, möglichst kombiniert werden. Ein Vorbehalt der Analyse ist, dass Fett-Mutanten winzige Mengen an PUFAs in Würmer ausreichend für PG-Synthese sind. Zum Beispiel Fett-2 (WA17) Mutanteneine kleine Menge von D12 Desaturaseaktivität (~ 5% der Wildtyp-22) und diese Mutanten noch produzieren PGs 6. fat-3 (WA22) und Fett-4 (WA14) Mutanten nicht zu PGs aus Arachidonsäure und Eicosapentaensäuren 16 abgeleitet synthetisieren . Wir haben auch festgestellt, dass Fett Mutanten für den Verlust von PUFA Klassen durch Hochregulierung PG-Synthese aus den verbleibenden Klassen kompensieren. Zum Beispiel, nicht Fett-3 (WA22) Mutanten, die meisten PGs aus 20 Kohlenstoff-PUFAs synthetisieren abgeleitet. Stattdessen werden sie bis zu regulieren Roman PGs aus 18 Kohlenstoff-PUFAs 16 abgeleitet. Bis heute haben wir keine C. identifiziert elegans-Stamm, der völlig unzulänglich in PG-Synthese ist. Es ist möglich, dass PGs essentiell für das Wachstum oder Entwicklung.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den UAB Targeted Metabolomics und Proteomics Laboratory, die zum Teil wurde von der UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 zu C. Elmets), die UAB-UCSD O'Brien akuten Nierenschädigung Zentrum (P30 DK079337 A. Agarwal unterstützt ) und die UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 JE Blalock). Unterstützung für das Massenspektrometer war von einem NCRR Gemeinsame Besetzung Zuschuss (S10 RR19261 auf S. Barnes). Wir danken auch Ray Moore für den technischen Support. C. elegans-Stämme wurden durch die Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH ist. Diese Arbeit wurde durch die NIH (R01GM085105 zu MAM, darunter ein ARRA administrative Ergänzung) unterstützt.
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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