في هذه الورقة، نحن تصف الإجراء الأمثل لاستخراج وتحليل البروستاجلاندين وغيرها من eicosanoids<em> C. ايليجانس</em> باستخدام LC-MS/MS.
انواع معينة ايليجانس والناشئة باعتبارها نموذج حيواني قوية لدراسة بيولوجيا الدهون 1-9. البروستاجلاندين هي فئة هامة من eicosanoids، والتي هي إشارات الدهون المشتقة من الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) 10-14. هذه الجزيئات يشير يصعب الدراسة بسبب وفرة منخفضة وطبيعة رد الفعل. ميزة مميزة البروستاجلاندين هو بنية حلقة السيكلوبنتان تقع داخل العمود الفقري الأحماض الدهنية. في الثدييات، يمكن تشكيل البروستاجلاندين عن طريق انزيمات الأكسدة الحلقية الممرات ومستقلة تعتمد على إنزيم 10،15. C. ايليجانس يجمع مجموعة واسعة من البروستاجلاندين مستقلة عن cyclooxygenases 6،16،17. تم التعرف على فئة كبيرة من البروستاجلاندين F-سلسلة، ولكن دراسة eicosanoids هو في مرحلة مبكرة مع مجالا واسعا لاكتشافات جديدة. نحن هنا وصف الإجراء لاستخراج وتحليل البروستاجلاندين وeicosanoids الأخرى. الدهون مشحونةيتم استخراج S من الثقافات دودة الشامل باستخدام تقنية استخراج السائل السائل وتحليلها من قبل اللوني السائل بالإضافة إلى electrospray التأين بالترادف الطيف الكتلي (LC-ESI-MS/MS). إدراج النظير بالديوتيريوم البروستاجلاندين، مثل PGF 2 α-D 4 كما ينصح معيار الداخلية للتحليل الكمي. رصد رد فعل متعددة أو MRM يمكن استخدامها لقياس ومقارنة أنواع البروستاجلاندين محددة بين الحيوانات البرية من نوع ومتحولة. التحلل بفعل الاصطدام أو MS / MS يمكن استخدامها للحصول على معلومات حول الميزات الهيكلية الهامة. اللوني السائل قياس الطيف الكتلي (LC-MS) بالاشعة مسح لمجموعة وكتلة مختارة، مثل م / ض 315-360 يمكن استخدامها لتقييم التغيرات العالمية في مستويات البروستاجلاندين. نحن نقدم أمثلة على كل التحليلات الثلاثة. وهذه الطرق توفر للباحثين مع مجموعة أدوات لاكتشاف eicosanoids الرواية وترسيم ممراتها الأيضية.
البروستاجلاندين (PGS) هي فئة هامة من الهرمونات الدهون التي تم التحقيق فيها على نطاق واسع وتورط في تنظيم الاستنساخ، والحصانة، والتنمية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية 12-14. هي مناسبة بشكل مثالي لPGS تحليلات شاملة بيولوجيا الأنظمة لأنها تضم سلسلة من الدهون المستمدة من السلائف الشائعة (ق). الديدان الخيطية C. ايليجانس هي واحدة من الكائنات النموذج الأكثر استخداما لمعالجة المسائل الأساسية في علم الوراثة وبيولوجيا الأنظمة.
لقد أثبتنا أن C. ايليجانس يجمع PGS F-سلسلة دليل أن الحيوانات المنوية القادرة على الحركة إلى البويضات 3،6،16. وقد تم تحديد PGS F-سلسلة المستمدة من PUFAs 20 الكربون مع ثلاثة، أربعة، وخمسة السندات المزدوجة، التي تتألف منها F1، F2، F3 والطبقات، على التوالي 3،16. وقد تم تجميع هذه PGS مستقلة من الانزيمات انزيمات الأكسدة الحلقية، بعد PGF الفراغية 2α 1α وPGF لا تزال شركة جنرال الكتريكnerated. لتحليل نوعي وكمي للC. ايليجانس PGS، LC-MS/MS هو تقنية تحليلية قوية وحساسة. قبل تنفيذ هذا التحليل، فإنه من المهم لتطوير طريقة استخراج الأمثل لأداء العملية التحليلية يعتمد بشكل كبير على جودة استخراج. يمكن اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي توفر سوى الشامل المتوقع لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض)، وكذلك مرغوب فيه ذروة الشكل والوقت الإبقاء على أيون الوالد PG. التنميط الأيضية من PGS في C. ايليجانس هي مهمة صعبة تتطلب مختلف استراتيجيات اكتساب MS.
LC-MS مسح كامل أو المسح الضوئي (Q1 المسح الضوئي) لديه ميزة ضمان سوف PGS أن معظم ionizable توليد استجابة الطيفي الشامل. في حين يوفر المسح مسح معلومات مفيدة عن التنميط مجموعه PGS فيما يتعلق البرية من نوع ومتحولة C. ايليجانس، والكشف عن PGS قاصر للخطر نظرا لحساسية منخفضة. Nevertheأقل، يمكن أن LC-MS المسح مسح إعطاء نظرة شاملة من PGS ومفيد بشكل خاص لتحليل المسوخ وتوقع أن تؤثر على عملية التمثيل الغذائي للسكان PG كبيرة.
في تحديد المستقلب، يتم تنفيذ تحليل LC-MS/MS المعايير PG تصنيعه كيميائيا أولا للحصول على الأطياف ايون المنتج ومركبات المرجعية. ويمكن مقارنة هذه الأطياف لطيف وهو مستقلب غير معروف. يتم استخدام رصد وضع العديد من رد فعل (MRM) لتعزيز حساسية وخصوصية. ويتم إنجاز تجربة MRM لتحديد أيون / المنتج أيون التحول الشامل الرئيسي للمركب. من خلال معرفة كتلة وهيكل التحاليل الهدف، فمن الممكن التنبؤ التحولات MRM النظرية لكثير من مستقلبات غير معروفة.
طريقة LC-MS/MS الأمثل لالتنميط PGS ايزوميريا في C. ولم ترد أي أنباء ايليجانس. هنا نحن تصف استخراج ونهج متكامل مطياف الكتلة المكونة من LC-MS وLC-MS / MS طرق للكشف عن، والتحديد الكمي، والتحقيق C. ايليجانس PG الأيض. ويمكن تطبيق هذا النهج لeicosanoids الأخرى.
نحن تصف الإجراء لاستخراج وتحليل eicosanoid، مع التركيز على PGS F-سلسلة. هناك عدة أجزاء من الإجراء الذي يمكن أن يكون مشكلة. أولا، من المهم جدا أن الثقافات دودة لا يتضورون جوعا، والمجاعة يمكن أن يغير الأيض PG. للتغذية تكميلية، وينصح NA22 البكتيريا بدلا من أكثر شيوعا OP50 البكتيريا بسبب NA22 تصل كثافة أعلى. ومع ذلك، فإن سلالة NA22 يفتقر إلى مقاومة المضادات الحيوية، وأكثر عرضة للتلوث. الثانية، والديدان توليف الهكسان PG الفردية في وفرة منخفض نسبة إلى أنسجة الثدييات. هذا قد يكون راجعا في جزء منه إلى التكرار بين العديد من الهكسان. نوصي حوالي 6 غرام من الأنسجة لتحليل شامل وإشارات أقوى. أقل الأنسجة (1-2 غرام) يمكن استخدامها إذا هو معلق استخراج المجففة في أقل الميثانول: حل المياه لزيادة تركيز PG. ومع ذلك، والحقن 1-2 فقط لا يمكن أن يؤديها. الحد من الكشف عن نظام LC-MS/MS لدينا حوالي 10 خريجPGF 2α / مل. واحد مل من المكتظ الديدان المرحلة المختلطة (حوالي 1 ز) تعطي ما يقرب من 25-50 خريج من CePGF2. ويمكن لنظم قياس الطيف الكتلي أكثر حساسية تقليل كمية الأنسجة دودة المطلوبة للتحليل. الثالث، والاختلافات في PG كفاءة الاستخراج بين عينات يمكن أن يسبب نتائج متغير. لقد وجدنا أن كفاءة الاستخراج هي مشابهة جدا عندما يتم استخراج الأنسجة بشكل متواز. لتحديد الكفاءة، إضافة 1.0 نانوغرام من PGF 2α-D 4 في خطوة التجانس باعتبارها الرقابة الداخلية. MRM باستخدام التحول الشامل M / Z يستخدم 357/197 لقياس PGF 2α-D4 التركيز النسبي إلى 1 نانوغرام / مل حل القياسية. ثم يتم احتساب مبلغ PGF 2α-D 4 المفقود خلال الاستخراج.
المعلمات اللوني والتحولات الشامل ندرج يمكن تغييرها لكشف PGS وeicosanoids الأخرى. على الرغم من الجهد الكبير، ونحن لم تكن قادرة على تحديد D-سلسلة أو E-سرالمنشأ PGS في مقتطفات 17. وعلاوة على ذلك، ونحن لم الكشف عن 8-ISO PGF 2α و 8 ISO PGE 2 التي هي سمة من بيروكسيد مجانا بمبادرة الراديكالية، الذي يولد خليط غير انتقائية من PG الفراغية 19. سواء الديدان تجميع أنواع PG الأخرى غير معروف. تم العثور على Endocannabinoids ومختلف الايبوكسي وهيدروكسي الأيضات من الأراكيدونيك والأحماض الدهني في C. ايليجانس مقتطفات 5،7،20،21. من المستحسن استخدام كل من MRM وMS / MS بالمقارنة مع معايير أصيلة لتقدير وتحديد الهوية، على التوالي. لeicosanoids الرواية، ينبغي الجمع بين هذه التحليلات مع دراسة مقارنة من المسوخ الدهون، والتي تعاني من نقص في بوفا توليف الانزيمات 22، فضلا عن فحص وظيفية، إذا كان ذلك ممكنا. والتحذير لتحليل المسوخ الدهون هو أن كميات دقيقة من PUFAs موجودة في الديدان هي كافية لتخليق PG. على سبيل المثال، والدهون-2 (wa17) المسوختحتوي على كمية صغيرة من D12 النشاط desaturase (~ 5٪ من النوع البري 22) وهذه المسوخ ما زالت تنتج PGS 6. الدهون 3 (wa22) والدهون 4 (WA14) المسوخ تفشل في تجميع PGS المستمدة من الأراكيدونيك والأحماض الدهني 16 . ونحن أيضا قد وجدت أن المسوخ الدهون تعويض عن فقدان الطبقات بوفا بنسبة تصل التنظيم التوليف PG من الطبقات المتبقية. على سبيل المثال، فشل الدهون 3 (wa22) المسوخ لتجميع معظم PGS المستمدة من PUFAs 20 الكربون. بدلا من ذلك، فإنها تظهر ليصل تنظيم PGS الرواية المستمدة من الكربون 18 PUFAs 16. حتى الآن، ونحن لم تتعرف على C. ايليجانس السلالة التي تعاني من عجز تماما في التركيب PG. فمن الممكن أن PGS ضرورية لنمو أو تنمية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الايض UAB المستهدفة ومختبر البروتيوميات، والتي تمت بدعم في جزء من الجلد مركز بحوث أمراض UAB (P30 AR050948 إلى C. Elmets)، ومركز جامعة كاليفورنيا سان دييغو UAB-اوبراين الحادة الكلى الإصابة (P30 DK079337 إلى A. أغاروال ) ومركز صحة الرئة UAB (R01 HL114439، R01 HL110950 إلى JE بلالوك). وكان الدعم لمطياف الكتلة من NCRR المشتركة الأجهزة منحة (S10 RR19261 إلى S. بارنز). كما نشكر راي مور لتقديم الدعم التقني. C. وقدمت سلالات ايليجانس من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة، والذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01GM085105 إلى MAM، بما في ذلك الملحق الإداري الأذربيجانية).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|