Aquí presentamos un método electrofisiológico basado en membranas de soporte sólido con el foco en sus aplicaciones para la caracterización de transportadores de membrana electrógenos.
El método electrofisiológico se presenta se basa en una membrana sólida apoyado (SSM) compuesta de una capa octadecanotiol quimisorbida sobre un chip sensor recubierto de oro y una monocapa de fosfatidilcolina en la parte superior. Este conjunto está montado en un sistema de cubeta que contiene el electrodo de referencia, un alambre de plata clorada.
Después de la adsorción de fragmentos de membrana o proteoliposomas que contienen la proteína de membrana de interés, una bolsa de solución rápida se utiliza para inducir la actividad de transporte de la proteína de membrana. En la solución de un solo cambio de protocolo dos soluciones, se necesitan uno no activación y una solución activadora,. El flujo es controlado por un sistema de válvula y el tubo de aire a presión y dentro de una jaula de Faraday.
La cinética de la actividad de transporte electrogénico se obtiene a través de acoplamiento capacitivo entre el MSE y los proteoliposomas o fragmentos de membrana. El método, por lo tanto, produce sólo transiencamisetas corrientes. La corriente de pico representa la actividad de transporte estacionaria. Las corrientes transportador dependientes del tiempo pueden ser reconstruidos por el análisis de circuitos.
Este método es especialmente adecuado para transportadores de procariotas o eucariotas transportadores de las membranas intracelulares, que no pueden ser investigadas por patch clamp o métodos de fijación de voltaje.
Aquí se demuestra un nuevo enfoque electrofisiológico basado en una membrana de apoyo sólido (SSM) para la caracterización de las proteínas de membrana electrógenos.
El soporte sólido consiste en una capa delgada de oro sobre un portaobjetos de vidrio, el chip del sensor. La superficie de oro hidrófilo se utiliza para enlazar el grupo tiol de un reactivo alcanethiol. Después, selfassembly de un monolyer fosfatidilcolina completa la formación de la SSM.
Para medir reacciones electrógenos de proteínas de membrana, proteoliposomas o fragmentos de membrana se adsorben a la SSM (Figura 1). La proteína que contiene la membrana y el MSE a continuación, formar un sistema de membrana acoplado capacitivamente. Por lo tanto, la translocación de carga en la membrana que contiene la proteína puede ser detectada por acoplamiento capacitivo a través de la SSM. Este método produce sólo corrientes transitorias. La corriente de pico representa la actividad de transporte estacionaria. La cu transportador dependiente del tiemporrents puede ser reconstruido por el análisis de circuitos.
El chip sensor está montado en un sistema de cubeta (Figura 2). La cubeta tiene un volumen cubeta cilíndrica de 17 l (volumen neto con junta tórica montada). Un pasador de resorte de contacto crea el contacto con el amplificador. Un conector de salida está atornillado a la parte superior de la parte principal y lleva el electrodo de referencia, un alambre de plata clorada.
La cubeta está montado en una jaula de Faraday. Está conectado a una vía de fluido, que se utiliza para inducir la actividad de transporte de la proteína de la membrana en respuesta a un cambio de solución rápida (Figura 3). En la solución de un solo cambio de protocolo dos soluciones, se requieren un no-activación y una solución activadora,. El flujo es controlado por aire a presión usando un software de control de la válvula en un ordenador o interruptores manuales en una caja de interfaz.
1. Ventajas de electrofisiología MSE basado en comparación con los métodos convencionales
Electrofisiología SSM basada ha demostrado ser una herramienta valiosa de la caja de herramientas electrofisiológico. Es especialmente útil en los casos en que la convención de electrofisiología, es decir, patch clamp y los métodos de fijación de voltaje, no se puede aplicar: Salvo algunas raras excepciones transportadores de bacterias no pueden ser investigados mediante abrazadera de tensión o métodos de patch clamp, debido al pequeño tamaño de las bacterias y porque que son difíciles de expresar en células de mamífero u oocitos. Pero también fisiológicamente transportadores de mamíferos pertinentes pueden ser investigados. En este caso electrofisiología MSE basado es atractivo para los transportadores de las membranas intracelulares y para aplicaciones de detección en el descubrimiento de fármacos debido a su robustez y su potencial para la automatización.
SSM-basedUsing electrofisiología, el tiempo caracterización resuelto convencional de transporta ores es un reto. Dado que el volumen de negocios de los transportistas es bajo un "parche gigante o se requiere la configuración de una" célula entera ", que tiene una resolución de por sí bajo el tiempo en un experimento de cambio de solución. La complicación puede ser superada mediante la liberación sustrato fotolítica. Sin embargo, sólo un número limitado de sustratos son adecuados para este enfoque. Aquí el intercambio solución rápida a la SSM ofrece la oportunidad única de realizar estudios electrofisiológicos con una alta resolución temporal utilizando sustratos arbitrarias.
2. Limitaciones y pasos críticos
En contraste con patch clamp y técnicas de fijación de voltaje, la electrofisiología MSE basado no se puede utilizar para aplicar un potencial. Por lo tanto, la caracterización Transportador se limita a los modos de transporte que no se basan en un potencial de membrana.
En general, la electrofisiología MSE basado no tiene limitaciones en cuanto al tipo del transportador (electrogénico). Pero cl voltajeamplificador o parche métodos de sujeción pueden tener ventajas, si se requieren componentes intracelulares como las proteínas de unión para la funcionalidad de proteínas.
Las limitaciones pueden surgir, en caso de cambio de solución crea grandes corrientes de artefactos. Esto sucede cuando el sustrato interactúa fuertemente con el MSE como en el caso de compuestos lipófilos. Artefacto controles se pueden utilizar para corregir las señales medidas. Además fondo elevado de sal en todos los tampones de medición se puede utilizar para reducir los artefactos. Sin embargo, en los casos, donde el tamaño del artefacto es comparable a la señal de la proteína, es casi imposible para aislar la señal de la proteína relacionada con el artefacto. Afortunadamente, los altos artefactos son inusuales en un intercambio solución optimizada.
Hay algunos pasos que son fundamentales para la realización con éxito de un experimento de electrofisiología SSM-based. La preparación de la muestra de proteína es la parte más importante. Si se utilizan proteoliposomas, asegúrese de que las reconstución proceso produce una muestra limpia, reproducible de una LPR suficiente y el transportador está orientado en la forma correcta. La LPR se puede comprobar por congelación fractura microscopía y la orientación de electrones por un experimento ELISA de anticuerpos si están disponibles.
Utilice sólo un SSM que muestra los parámetros óptimos para la incubación de la muestra de proteína. La inyección de la proteína es un paso crítico. La sonicación es esencial y las burbujas de aire se deben evitar durante la inyección. Después de la incubación de la muestra el propio mediciones son fundamentales, ya que las burbujas de aire se retire la muestra de proteína adsorbida del chip sensor. Por lo tanto siempre eliminar las burbujas de aire después de cambiar las soluciones. Sin embargo, puede ocurrir un resumen de la señal. Para corregir una posible señal de resumen, es esencial para llevar a cabo controles degradadas durante el experimento.
3. Sistemas Especializados
La SSM-Setup se puede modificar en función de su aplicación. Por otra parte taquí son completamente diferentes configuraciones, altamente especializados disponibles.
Existe la posibilidad de medir señales de la proteína en condiciones asimétricas, por ejemplo en virtud de un gradiente de pH. Para establecer composiciones tampón asimétricos dentro y fuera de los proteoliposomas tercera solución, la solución en reposo, tiene que ser introducido y esto requiere una configuración de doble intercambio. Aquí se requiere una conmutación entre las soluciones no-activación y de reposo de la válvula de tres vías adicional.
Para aumentar la resolución de tiempo del sistema que hemos desarrollado una vía de flujo alternativo que carece de la válvula de terminal, pero usando un tipo diferente de cubeta. Aquí la unión de activación y la solución no activación se encuentra dentro de la cubeta, 3 mm en frente de la SSM. Esta configuración es muy adecuado para análisis de la cinética de los procesos de transporte rápido. Se pudo demostrar que el tiempo de resolución tan bajo como 2 ms es posible.
F Comercialully sistemas automatizados están disponibles con el objetivo de un rendimiento significativamente mayor para la detección de drogas. Una unidad móvil recoge soluciones y los inyecta en la superficie del sensor en placas de 96 pocillos en un formato de placa de microtitulación estándar.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a J. García-Celma, me Smirnova y R. Kaback para las contribuciones a las medidas de encaje y E. Bamberg de apoyo y útil para los debates.
Materials | |||
Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
O-rings | Seal Science Inc. | ||
Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Amplifier | Keithley | 427 | |
Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
Regeants | |||
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |