מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

1. התקנתו של מנגנון לאלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM פרטים ניתנים בשניים מהפרסומים הטכניים שלנו, אשר כוללים גם ציורים ותצלומים של cuvettes סכמטיים ולהגדיר 1, 2. תצורות חליפין פתרון אחרות ופרוטוקולי תזרים הם דנו גם בשיטת הנייר 2 שלנו. בחלק הבא נוסיף כמה שיפורים אחרונים ופרטים טכניים שיש בם שייכות ישירה למצגת וידאו. שסתום בקרה ורכישת נתונים התיבה מכילה ממשק USB ממשק מסחרי דיגיטלי פלט / קלט אנלוגי (6009 מכשירי NI USB הלאומיים) ואת מנהלי התקנים שסתומים. היא שולטת על זרימת הפתרון, והוא אחראי לרכישת נתונים. שסתומים בדרך כלל מונעים עם 12 V. עם זאת, עבור מהר מיתוג יכולים להיות מונעים את השסתומים עם מתח של עד 18 ו 'בסרטון אנו משתמשים V אספקת חשמל 12. </P> המעגלים נהג הסתום יכולים לפעול ארבעה שסתומים. זה היה מיוצר על ידי הסדנה של מכון מקס פלנק לביופיסיקה. יכול להיות נשלט על ידי מחשב או באופן ידני באמצעות מתגים שסתום בפנל הקדמי. האחרון הוא נוח לשטיפה וניקוי-נהלים. בזמן מדידה, תיבת הממשק היא מבוקרת מחשב באמצעות שליטת סתום ותוכנת רכישת נתונים (SURFE תוכנת R 2, IonGate Biosciences). 2. הכנות בסעיף זה בפרוטוקולים השונים להכנת ניסוי electrophysiology מבוסס SSM מוזכרים. 2.1 ביצוע פתרון השומנים להיווצרות SSM מערבבים 25 Octadecylamine μl (5 מ"ג / מ"ל ​​בכלורופורם) ו375 Diphytanoylphosphatidylcholine μl (20 מ"ג / מ"ל ​​בכלורופורם) בבקבוקון גלאס. שימוש במאייד סיבובי וזרימת גז חנקן רציפה, מתאדה לכלורופורםכ -30 דקות. הסר את השומנים מקירות בקבוקון הזכוכית על ידי טלטול עם 500 μl של n-decane. ריכוז השומנים הסופי הוא 15 מ"ג / מ"ל ​​עם 1:60 (w / w) octadecylamine. מעבירים את הפתרון לאחסון בקבוקון הזכוכית. אחסן את פתרון השומנים בדם ב -20 ° C. 2.2 הכלרה של האלקטרודה ההתייחסות האלקטרודות התייחסות צריכה להיות כלור במרווחים זמן קבוע עקב שחיקה. הסר את המשענת של שכבת silverchloride הישנה באמצעות נייר זכוכית עדינה לפני תהליך כלורינציה. מניחים את חוט הכסף יחד עם אלקטרודה פלטינה לפתרון חומצה הידרוכלורית 1 M וchlorinate במשך 15 דקות ב 0.5 mA. לאחר שסיים את הכלרה, חוט הכסף משנה את צבעיו לצבע אפור כהה אחיד. 2.3 הכנת גשר ג'ל polyacrylamide להכין תמיסה המכילה 100 מ"מ KPI ב-pH = 7, 100 מ"מ KCl ו6Acrylamid%. הוסף APS 0.3% (10% מניות) ו0.6% TEMED וזמן קצר לערבב את הפתרון עם טפטפת. מייד לאחר ערבוב הפתרון, השתמש פיפטה להזריק 30 μl של התערובת לתוך המכל גשר ג'ל הריק. זה חשוב כדי למנוע בועות אוויר בזמן ההזרקה. במהלך זמן דגירה של 20 דקות ג'ל polymerizes. לאחר פילמור גשר הג'ל מאוחסן בפתרון (100 מ"מ KPI 7-pH, 100 מ"מ KCl). כדי להאריך את תוחלת החיים של גשר ג'ל הפתרון מאוחסן ב 4 ° C. 2.4 הכנה של פתרונות המדידה בשל האינטראקציה החזקה של מומסים עם SSM, חפצים חשמליים נוצרים כאשר פתרונות של הרכב שונה הם החליפו. לכן, ההכנה של פתרונות היא שלב קריטי. לנקוט באמצעי הזהירות הבא במהלך תהליך הכנת הפתרון ללמזער חפצי חליפין פתרון. הפוך ללא הפעלה והפעלת פתרונות מצרור אחד, להתאים את ה-pH וחוזק יוני. רקע מלח גבוה עוזר להפחית חפצי חליפין פתרון. מחלקים את הפתרון אצווה לשני כרכים. הוסף את מתחם ההפעלה להפעלת הפתרון. השתמש במתחם מפצה בפתרון שאינו המפעיל לשמור osmolarity וחוזק יוני של שני פתרונות דומים ככל האפשר. אם פתרונות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס, לוודא שכל פתרונות הגיעו טמפרטורת חדר לפני תחילת מדידה, משום שאפילו הבדלים קטנים בטמפרטורה יכולים לייצר חפצים. 3. ניסוי Electrophysiology מבוסס SSM כאן אנו מציגים פרוטוקול טיפוסי לניסוי אלקטרו מבוסס SSM. 3.1 הכנת תוכנית ההתקנה SSM בעוד הגדרת SSM אינה בשימוש הצינורות מלאים ב30% אתנולפתרון / מים כדי למנוע התפתחות חיידקים. שטוף את המערכת עם מים טהורים כדי להסיר אתנול מהצינור לפני ההרכבה קובט. להחליף את מכולות אתנול עם מיכלי מים. שימוש בלחץ גבוה (0.6-1.0 בר) לנקות את המערכת עם 20-30 מיליליטר מים. חזור על תהליך הניקוי באמצעות חיץ 100 מ"מ KPI ב-pH 7.6 או פתרון שאינו מפעיל. ודא שאין בועות אוויר להישאר במערכת הנוזל. 3.2 הרכבה קובט צרף O-טבעת לאלקטרודה ההשוואתית קח את גשר ג'ל מפתרון האחסון ולחבר את האלקטרודה ההפניה. מלא מראש המחבר לשקע עם חיץ ללא הפעלה, הכנס O-טבעת ולחבר את גשר ג'ל כדי להשלים את מכלול אלקטרודה ההשוואתית. קח טיפול מיוחד שאין בועות אוויר בצומת של גשר ג'ל ומסלול זרימת הפתרון לשקע. Preassemble חלק העיקרי של cuveטטי ידי הוספת סיכת אביב קשר (חיבור למגבר), את צינור היניקה (חיבור לשסתום המסוף), O-הטבעת (איטום עבור SSM) ואת הברגים. השימוש בפינצטה, לקחת את שבב החיישן מתוך פתרון האחסון (octadecanethiol 10 מ"מ באתנול). בעזרת פיפטה, לשטוף את הפתרון שנותר עם כ. 5 מ"ל של אתנול טהור. ייבש את האלקטרודה בגז חנקן. הנח את שבב החיישן במדויק על חלק הבסיס של קובט, כך שהכניסה של שעמם את החלק העיקרי של קובט מופנה לאזור הפעיל המעגלי של החיישן. הוסף μl 1 של פתרון השומנים בדם לאזור הפעיל של שבב החיישן. ודא, ששכבת הזהב מכוסה באופן מלא על ידי השומנים בדם. מייד לאחר הוספת פתרון השומנים בדם, לסגור את קובט על ידי הוספת החלק העיקרי preassembled. לפני ההרכבה קובט לתוך כלוב פאראדיי, כדי להיות בטוח שכל המשטחים הם יבשים לחלוטין. מחוליתECT המגבר לפין ליצירת קשר ואת צינור יניקת האביב לשסתום המסוף. לאחר מכן לתקן קובט עם הברגים בתוך כלוב פאראדיי. הברג את המחבר לשקע לחלק העליון של קובט. סוף סוף לחבר את צינור היציאה למחבר לשקע והמחולל המתח לאלקטרודה ההשוואתית. מייד לאחר ההרכבה קובט לשטוף את המערכת עם חיץ ב0.6 בר. זה מוביל להיווצרות ספונטנית SSM. 3.3 פרמטרים קרום מדידה כדי לבדוק את איכות SSM, קיבול ומוליכות נמדדים באמצעות מחולל הפונקציה. באמצעות מחולל הפונקציה, להחיל מתח DC 100 mV למדוד את המוליכות. חשב את המוליכות: הריקבון הנוכחי מראה טעינה של קבל הממברנה. לאחר הקבל טעון באופן מלא את התשואות הנוכחיות מדדו את מוליכות הקרום באמצעות חוק אוהם. לשם פשטות אנו משתמשים מ"קrrent 1 שניות לאחר המתח החשמלי כדי לחשב את מוליכות G = אני / U. החל מתח AC משולש של 50 mV שיא לשיא האמפליטודה ותדירות של 0.5 הרץ למדוד את הקיבול. חשב את הקיבול: המשרעת של הגל המרובע הנוכחי המתקבל מייצגת את זרמי הטעינה של הקבל. C הקיבול שווה למטען המועבר ש = IΔt מחולק ΔU = 100 mV. (ΔU הוא פי שניים מהמתח להחיל של 50 mV כי אני הוא הבדל השיפוע החיובי מינוס שלילי הנוכחי של המתח המשולש.) לפקח על הפרמטרים החשמליים של הקרום שוב ושוב כל 10 דקות לכ. 30 עד 40 דקות, עד שהם הגיעו לערכים קבועים. לשטוף עם חיץ בין KPI בלחץ גבוה בטווח של כ 0.6-1 הבר. להעריך את איכות SSM: פרמטרים אופטימליים הם בטווח של 0.1-0.2 nS ו2-3.5 NF. מוליכות גבוהות מעל 0.8 קיבול nS והנמוך מתחת nF 1 מציינתשSSM לא כהלכה נוצר. קיבול גבוה מעל 4 nF עשוי לרמוז כי האזור הפעיל אינו מכוסה לחלוטין על ידי SSM. אם הפרמטרים אינכם נמצאים בטווח האופטימלי, הקרום אמור להיות מושלך וSSM אחר הכין, באמצעות שבב האלקטרודה מוכן טרי. 3.4 בדיקת חפצי חליפין פתרון לאחר שבדקו את הפרמטרים בממברנה, שמאגרי המדידה צריכים להיבדק על חפצי חליפין פתרון. הכנס את מכולות הפתרון המתאימות למערכת הנוזל. הסר בועות אוויר ממערכת הנוזל, באמצעות שסתומים הידניים. שימוש בתוכנת רכישת נתונים בחר בפרוטוקול הזרימה ברצונך להשתמש בניסוי שלך. התאם את לחץ 0.6 בר ולהתחיל את המדידה. מלבד חפצי מיתוג השסתום מכאניים, יש למדוד אידיאלי אין זרמי ממצא או שהם צריכים להיות הרבה SMAller מאותות התחבורה החלבון הצפויים. אם חפצי חליפין פתרון הם נצפו, מנסים לייעל את הקומפוזיציות ו / או בהליך הכנת חיץ לפני שתמשיך את הניסוי. 3.5 הוספת מדגם החלבון בדרך כלל proteoliposomes או שברים בממברנה מאוחסנים קפוא ב -80 ° C. למדידה אחת יש צורך aliquot של כ -30 μl. יש לשטוף את SSM עם פתרון שאינו מפעיל. להפשיר את דגימת החלבון על קרח. שלושה מחזורים של 10 שניות sonication לסירוגין עם הפסקות של 10 שניות קירור על קרח. Proteoliposomes הם sonicated באמצעות sonicator אמבטיה. לברי קרום משמש sonicator קצה (50W, 30 kHz, 1 מ"מ קוטר sonotrode, עצמת 20%, מחזור 0.5). לאחר שלב sonication האחרון לא לשים מדגם חזרה על קרח, אבל להזריק אותו מייד לקובט. הבריגו החוצה את שקע מחבר יחד עם התייחסות האלקטרודה assembly. בעזרת פיפטה, לשאוב 30 μl של מדגם החלבון ולעלות את קצה פיפטה לשקע נשא. פתח את השסתום הידני במסלול שאינו המפעיל למכל הפסולת ולהזריק את proteoliposomes לתוך נפח קובט. היזהר שלא להזרים אוויר לתוך נפח קובט עם החיישן. לפני הסרת קצה פיפטה, לסגור את השסתום הידני כדי למנוע זרימת פתרון נוספת. לאפשר לproteoliposomes כדי לספוג לSSM לזמן דגירה של שעות 1 ל -2. כמו כן ניתן לדגירת הלילה. 3.6 נוהל כללי של ניסוי מבוסס SSM לחמם את מאגרי המדידה בזמן, אם מאוחסן ב 4 ° C. כל מאגרי המדידה צריכים להיות בטמפרטורת חדר לפני תחילת המדידה, כדי למנוע חפצים. כאשר פתרונות שינוי, קודם לנקות את הצינורות בתוך מיכלי הפתרון עם רקמה הלא fuzzing, לאחר מכן להוסיף את הבקבוקים החדשים. לפני שמתחיל את המדידה, להשתמש בשסתומים הידניים כדי להסיר בועות אוויר, שיכול להתפתח מהליך שינוי. התאם את הלחץ רק לפני התחלת מדידה. אנו משתמשים באופן שגרתי בלחץ של 0.6 בר אשר בשסתום וצינור תצורה הספציפי שלנו מניבה קצב זרימה של כ 1.0 מ"ל / שנייה. יכולים להתבצע בכמה המדידות הראשונות ישר אחד אחרי השני ויש לדחות עד לשיא הנוכחי נשאר קבוע. אם פתרונות שונים ברמת חומציות נחוץ זמן דגירה של לפחות 3 דקות כדי להתאים את ה-pH הפנימי של proteoliposomes לפני התחלת המדידה. עכשיו להגדיר מוכן למדידה. כדי להפחית את הרעש לפחות 3 מדידות צריכים להיעשות בממוצע. 3.7 מדידות בקרה סקירה אות בסדרה של מדידות יכולה להתרחש עקב פירוק חלבונים או הפסד של ספיחה. כל ניסוי SSM אני צריך nclude שליטה מוזנחת. הדבר נעשה על ידי מדידות חוזרות ונשנות עם פתרונות זהים. השליטה מינימאלית המוזנחת כלומר מדידה אחת בהתחלה ואחת בסוף הניסוי, תוך שימוש באותו הפתרון. אנו ממליצים לעשות שליטה המוזנחת בתנאים שבו אתה מצפה משרעת הפסגה הגבוהה ביותר בניסוי. זה עושה את זה יותר קל לכמת את סקירה מהירה של האות. סקירה האות ניתן לכמת על ידי השוואה של עוצמות השיא של שני הפקדים המוזנחים. הערך באחוזי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש כדי לתקן את האותות שנמדדו על ידי בהנחת תלות ליניארית של זמן מוזנח. 3.8 בקרות Artifact אם אפשר לנסות לאמת את התוצאות שלך על ידי עיכוב החלבון של עניין לאחר הניסוי. אותות שנותרו הם כנראה חפצי חליפין פתרון. את האותות אז צריכים להיות מתוקנים לממצאים שנמדדו. <p c= "Jove_step"> 3.9 ילדה לאחר הניסוי שטוף את המערכת עם 20-30 מיליליטר מים טהורים ו20-30 מ"ל של אתנול / מים 30%. פתרון האתנולית מונע התפתחות חיידקים כאשר המערכת אינה בשימוש. לאחר תהליך הניקוי הזה, לשחרר את הלחץ מהמערכת וכבה את כל המכשירים. הסר את קובט מכלוב פאראדיי ולרדת בו. כל חלקי קובט ניתן לנקות עם מים ואתנול טהור, אם יש צורך, על ידי השימוש בsonicator אמבטיה. הנח את שבב החיישן בכוס גלאס עם אתנול טהור. Sonicate הכוס כ 1 עד 2 דקות באמצעות sonicator אמבטיה. ייבש את שבב החיישן מתחת לגז חנקן. אחסן את שבב חיישן מרחק של האור בפתרון האתנולית Octadecanthiol 10 מ"מ. לאחר זמן דגירה של כ -30 דקות שבב החיישן מוכן לשימוש חוזר.