Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

1. Criação de um aparelho para Eletrofisiologia baseado SSM Os pormenores são apresentados em duas das nossas publicações técnicas, que também contêm desenhos e fotografias dos nossos cuvetes esquemáticos e configurar 1, 2. Configurações de taxas de soluções diferentes e protocolos de fluxo também são discutidos em nosso trabalho o método 2. A seguir, adicione algumas melhorias recentes e detalhes técnicos que são de relevância direta para a apresentação de vídeo. Válvula de controle e aquisição de dados A caixa de interface contém um / interface comercial digital USB saída analógica de entrada (NI USB 6009 da National Instruments) e os controladores de válvulas. Ele controla o fluxo da solução e é responsável pela aquisição de dados. As válvulas são normalmente conduzidos com 12 V. No entanto, para uma rápida troca das válvulas pode ser conduzido com uma tensão de até 18 V. No vídeo, usamos uma fonte de alimentação de 12 V. </P> O driver da placa de circuito da válvula pode operar quatro válvulas. Foi fabricado pela oficina do Instituto Max Planck de Biofísica. As válvulas podem ser controlados por computador ou manualmente através de interruptores no painel frontal. O último é conveniente para os procedimentos de limpeza–e rubor. Durante a medição, a caixa de interface é controlado por computador usando uma válvula de controle e software de aquisição de dados (2 surfe R software, IonGate Biosciences). 2. Preparativos Nesta seção, são mencionados os diferentes protocolos para a preparação de um experimento de eletrofisiologia baseado SSM. 2.1 Fazendo a solução de lípido para a formação do SSM Misturar 25 ul octadecilamina (5 mg / ml em clorofórmio) e 375 Diphytanoylphosphatidylcholine ul (20 mg / ml em clorofórmio) num frasco Glas. Usando um evaporador rotativo e o fluxo de gás de azoto contínua, evapora-se o clorofórmio paracerca de 30 min. Remover o lípido a partir das paredes do tubo de vidro, com agitação, 500 mL de n-decano. A concentração final de lípido de 15 mg / ml, com 1:60 (w / w) octadecilamina. Transferir a solução para o frasco de armazenamento de vidro. Armazene a solução de lípido, a -20 ° C. 2.2 Cloração do eletrodo de referência Os eléctrodos de referência tem que ser clorada em intervalos regulares, devido à abrasão. Remover o resto da camada silverchloride idade, utilizando uma lixa fina antes do processo de cloração. Coloque o fio de prata juntamente com um eléctrodo de platina em uma solução de ácido clorídrico a 1 e clorar durante 15 min a 0,5 mA. Depois de completar a cloração, o fio de prata muda sua cor para um cinza escuro homogênea. 2.3 Preparação da Ponte de gel de poliacrilamida Prepara-se uma solução contendo 100 mM de KPi, pH = 7, KCl a 100 mM e 6% Acrylamid. Adicionar 0,3% de APS (10%) e por 0,6% TEMED e logo misturar a solução com uma pipeta. Imediatamente após a mistura a solução, utilizar uma pipeta de injectar 30 jil da mistura para dentro do recipiente vazio em gel de ponte. É importante para evitar as bolhas de ar durante a injecção. Durante um tempo de incubação de 20 min o gel polimerize. Após a polimerização da ponte gel é armazenado em solução (100 mM de KPi pH 7, 100 mM de KCl). Para prolongar a vida útil da ponte de gel, a solução é armazenada a 4 ° C. 2.4 Preparação das soluções de medição Devido à forte interação dos solutos com o SSM, artefatos elétricos são gerados quando as soluções de composição diferente são trocados. Portanto, a preparação das soluções é um passo crítico. Tome as seguintes precauções durante o processo de preparação da solução para minimizar taxas de artefatos de solução. Adicione não activação e a activação de um lote de soluções, ajustar o pH e força iónica. Fundo de alta sal ajuda a reduzir taxas de artefatos de solução. Dividir a solução em lotes em dois volumes. Adicionar o composto activador para a solução de activação. Utilização de um composto na solução de compensação não-activador para manter a osmolaridade e a força iónica de ambas as soluções tão semelhantes quanto possível. Se as soluções são armazenadas a 4 ° C, certifique-se que todas as soluções atinja a temperatura ambiente antes de iniciar uma medição, porque mesmo pequenas diferenças de temperatura pode produzir artefatos. 3. A Experiência Eletrofisiologia baseado SSM Aqui apresentamos um protocolo típico de um experimento eletrofisiológico baseado SSM. 3.1 Preparando o Setup SSM Enquanto a configuração SSM não está em uso, os tubos estão cheios com um 30% de etanolSolução / água para evitar o crescimento bacteriano. Lavar o sistema com água pura para remover o etanol a partir do tubo, antes da montagem da cuvete. Substituir os recipientes de etanol com recipientes de água. Utilização de alta pressão (0,6 a 1,0 bar) limpar o sistema com 20-30 ml de água. Repetir o processo de limpeza utilizando um tampão KPi 100 mM a pH 7,6 ou uma solução não-activação. Certifique-se de que não existem bolhas de ar permanecem no sistema fluido. 3.2 Montagem da cuba Anexar um o-ring para o eletrodo de referência Atravesse a ponte gel da solução de armazenamento e conecte o eletrodo de referência. Prefill o conector de saída com um tampão de não-ativação, insira um o-ring e ligar a ponte gel para completar a montagem do eletrodo de referência. Tome especial cuidado para que não há bolhas de ar na junção da ponte de gel e da solução via de fluxo de saída. Preassemble a parte principal do cuvette adicionando o pino de contacto de mola (ligação ao amplificador), o tubo de entrada (ligação à válvula do terminal), o anel de vedação (selagem para o SSM) e os parafusos. Usando uma pinça, tomar o chip sensor para fora da solução de armazenamento (10 mM octadecanethiol em etanol). Com uma pipeta, lave a solução restante com aprox. 5 ml de etanol puro. Seca-se o eléctrodo sob azoto gasoso. Colocar o chip sensor com precisão sobre a parte de base da tina de modo a que o orifício de entrada da parte principal da cuvete é dirigida para a área activa do sensor circular. Adicionar 1 ml de solução de lípido para a área activa do sensor chip. Certifique-se de que a camada de ouro é totalmente coberto pelo lipídico. Imediatamente após a adição da solução lipídica, fechar a cuba, acrescentando a parte principal pré-montada. Antes de montar o cadinho na gaiola Faraday, certifique-se que todas as superfícies estejam completamente secas. Connect o amplificador para o pino de mola de contacto e o tubo de entrada para o terminal de válvulas. Em seguida, fixar a cuba com os parafusos dentro da gaiola de Faraday. Parafuso do conector de saída para a parte superior da tina. Finalmente ligar o tubo de saída para o conector de saída e o gerador de tensão para o eléctrodo de referência. Imediatamente após a montagem da cuba lavar o sistema com tampão em 0,6 bar. Isto leva à formação de AGE espontânea. 3.3 parâmetros de membrana de medição Para verificar a qualidade do SSM, capacitância e condutância são medidos utilizando o gerador de função. Usando o gerador de funções, aplicar tensão de 100 mV DC para medir a condutância. Calcule a condutância: A decadência atual mostra o carregamento do capacitor membrana. Depois que o capacitor está totalmente carregado os rendimentos atuais de medição da condutância da membrana usando a lei de Ohm. Por razões de simplicidade, utilizar a current 1 segundo após a voltagem é aplicada para calcular a condutância G = I / U. Aplique uma tensão alternada triangular de 50 mV pico a pico de amplitude e uma freqüência de 0,5 Hz para medir a capacitância. Calcular a capacitância: A amplitude da corrente de onda quadrada resultante representa as correntes de carga do capacitor. A capacidade C é igual à carga transferida Q = IΔt dividido por? U = 100 mV. (? U é o dobro da tensão aplicada de 50 mV, porque é a diferença actual inclinação positiva de menos negativo da tensão triangular.) Monitorar os parâmetros elétricos da membrana repetidamente a cada 10 min aprox. 30 a 40 min, até que sejam atingidos valores constantes. Lave com tampão entre KPi a alta pressão na gama de cerca de 0,6 a 1 bar. Estimar a qualidade do SSM: parâmetros óptimos estão na gama de 0,1 a 0,2 ns e 2 a 3,5 nF. A alta condutância acima de 0,8 nS capacitância e baixa abaixo de 1 nF indicaque o MES não estiver correctamente formada. A alta capacidade acima de 4 nF pode implicar que a zona ativa não está completamente coberto pela SSM. Se os parâmetros não estão no intervalo óptimo, a membrana deve ser descartado e outro SSM preparado, utilizando um chip de eléctrodo recentemente preparada. 3.4 Verificação de taxas de artefatos de solução Depois que os parâmetros de membrana foram verificados, os buffers de medição devem ser testados para taxas de artefatos de solução. Inserir os respectivos recipientes de solução para o sistema de fluidos. Retirar as bolhas de ar do sistema de fluido, utilizando-se as válvulas manuais. Usando o software de aquisição de dados escolheu o protocolo de fluxo que deseja usar em sua experiência. Regule a pressão a 0,6 bar e iniciar a medição. Além dos artefatos de comutação de válvulas mecânicas, o ideal é não correntes artefato deve ser medido ou eles devem ser muito smaller do que os sinais de transporte de proteína esperadas. Se as taxas de artefatos de solução são observadas, tentar otimizar as composições de buffer e / ou o procedimento de preparação, antes de continuar o experimento. 3.5 Adição da amostra proteica Normalmente proteolipossomos ou fragmentos de membrana são armazenadas congeladas a -80 ° C. Para obter uma medição é necessária uma aliquota de cerca de 30 ul. Lavar o SSM com solução não-ativação. Descongelar a amostra de proteína em gelo. Três ciclos de sonicação de 10 seg são alternados com intervalos de arrefecimento de 10 seg em gelo. Proteolipossomos são sonicadas usando um sonicador de banho. Para fragmentos de membrana num sonicador ponta (50 W, 30 kHz, 1 mm de diâmetro sonotrodo, intensidade de 20%, ciclo de 0,5) é utilizado. Após a última etapa de sonicação não colocar a amostra de volta no gelo, mas injetá-lo imediatamente para a tina. Desparafuse a tomada de conector junto com o eletrodo de referência assembly. Usando uma pipeta, aspirar 30 ul da amostra de proteína e montar a ponta da pipeta para o furo de saída. Abrir a válvula manual na via não-activador para o contentor de lixo e os proteolipossomas injectar para dentro do volume da cuvete. Tenha cuidado para não injetar ar no volume de cuba com o sensor. Antes de retirar a ponta da pipeta, fechar a válvula manual para evitar mais fluxo de solução. Permitir que os proteolipossomas para adsorver o SSM para um tempo de incubação de 1 a 2 horas. É também possível a incubar durante a noite. 3.6 Procedimento geral de uma experiência baseada SSM Aquecer os buffers de medição de tempo, se forem armazenados a 4 ° C. Todos os tampões de medição têm de estar à temperatura ambiente antes de iniciar a medição para evitar artefactos. Ao mudar soluções, primeiro limpe os tubos no interior dos recipientes de soluções com um tecido não de difusão, em seguida, inserir as novas garrafas. Antes de iniciar a medição, utilizar as válvulas manuais para remover as bolhas de ar, o que poderia ter evoluído a partir do processo de transformação. Ajuste a pressão antes de iniciar uma medição. Rotineiramente usar uma pressão de 0,6 bar, que a página da válvula e o tubo específico configuração produz uma taxa de fluxo de aproximadamente 1,0 ml / seg. As primeiras medições pode ser realizado em linha reta um após o outro e deve ser rejeitado até que o pico de corrente continua constante. Se as soluções de pH diferem em um tempo de incubação de pelo menos 3 minutos é necessário para ajustar o pH interno dos proteolipossomas antes do início da medição. Agora, o set up está pronto para a medição. Para reduzir o ruído de pelo menos três medições devem ser feitas e uma média. 3.7 Medidas de controle Um resumo de um sinal durante uma série de medições pode ocorrer devido à degradação da proteína ou de uma perda de adsorção. Cada experimento SSM deve include um controle resumo. Isto é feito através de medições repetidas, com soluções idênticas. O controlo degradado mínimo significa uma medida no início e outro no final da experiência, utilizando a mesma solução. Recomendamos fazer o controle resumo sob condições em que se espera a maior amplitude de pico no experimento. Isto faz com que seja mais fácil de quantificar a degradação do sinal. O resumo do sinal pode ser quantificada por comparação das amplitudes de pico dos dois controles aperto. O valor percentual resultante pode ser utilizada para corrigir os sinais medidos, assumindo uma dependência do tempo linear degradado. 3.8 controles Artefato Se possível, tente validar seus resultados através da inibição da proteína de interesse após o experimento. Sinais restantes são provavelmente taxas de artefatos de solução. Os sinais então tem que ser corrigido para os artefatos medidos. <p class = "jove_step"> 3,9 Após a experiência Lavar o sistema com 20-30 ml de água pura e 20-30 ml de 30% de etanol / água. A solução etanólica evita o crescimento bacteriano, quando o sistema não está em uso. Após este procedimento de limpeza, liberar a pressão do sistema e desligar todos os instrumentos. Remover a cuvete da gaiola de Faraday e desmontá-lo. Todas as partes da cuvete pode ser limpo com água e etanol puro, se necessário, usando um sonicador de banho. Colocar o sensor chip numa proveta glas com etanol puro. Sonicar a proveta de cerca de 1 a 2 minutos usando um sonicador de banho. Seca-se o chip do sensor sob azoto gasoso. Armazenar o chip sensor de distância da luz, em uma solução etanólica 10 mM de Octadecanthiol. Após um tempo de incubação de cerca de 30 min o chip sensor está pronto para reutilização.