在这里,我们提出了一个基于固体产电膜转运特性及其应用重点支持膜的电生理方法。
的电生理的方法,我们提出基于在坚实的支持膜(SSM)组成的十八烷硫醇的化学吸附层上的金涂层的传感器芯片和磷脂酰胆碱单层之上。该组件被安装到一个反应杯中系统包含参比电极,氯化银焊丝。
吸附膜片段或包含感兴趣膜蛋白的蛋白脂质体后,快速的解决方案交换用于诱导的膜蛋白转运活性。在单一解决方案交换协议的两个解决方案,一个非激活和活化的解决方案,是必要的。的流是由一个法拉第笼内的加压空气,阀和油管系统。
生电转运活性的动力学是通过获得的SSM和蛋白脂质体或膜碎片之间的电容耦合。因此,该方法只产生transien吨电流。该峰值电流指在固定的传输活动。可重构的时间依赖转运电流电路分析。
此方法特别适用于原核的转运或真核转运蛋白从细胞内的膜,这是不能进行调查,通过膜片钳或电压钳方法。
在这里,我们展示了一个新的电生理方法的基础上支持了坚实的表征产电膜蛋白膜(SSM)。
的固体支持物包括一个薄的金层在载玻片上,传感器芯片。用于绑定的alcanethiol试剂的硫醇基团的亲水性的金表面。此后,自组装完成的卵磷脂好的单层SSM的形成。
为了测量生电反应的膜蛋白,蛋白脂质体或膜碎片被吸附到的SSM( 图1)。含蛋白质的膜和SSM形成电容耦合的膜系统。因此,上面的含蛋白质的膜的电荷易位可以通过电容耦合检测通过SSM。这种方法产生的瞬态电流。该峰值电流指在固定的传输活动。时间依赖的转运立方米可重构电路分析rrents。
的传感器芯片安装到一个反应杯中系统( 图2)。比色皿有一个圆柱形的比色皿17微升量(净体积与o型圈安装)。弹簧插针建立接触到放大器。一个出口连接器的主要部分的顶部螺合,并进行参比电极,氯化银焊丝。
的比色皿,安装在一个法拉第笼。它是连接到的流体的通路,这是用来诱导响应快速解决交换( 图3)的膜蛋白转运活性。在单一解决方案交换协议的两个解决方案,一个非激活和活化的解决方案,是必需的。流是由加压空气的使用了阀的控制软件上的计算机或手动开关的接口盒上。
1。基于SSM算法的电生理的优点与常规方法相比
基于SSM-电已经证明了自己的电工具箱作为一个有价值的工具。它是在哪里惯例电,即补丁钳和电压钳方法,可以不被应用尤其有用:除了一些罕见的例外细菌转运可以不进行调查,因为对细菌的小尺寸和因为使用电压钳或膜片钳方法它们很难在哺乳动物细胞或卵母细胞中表达。但也有关生理哺乳动物转运可以进行调查。在这种情况下,基于SSM算法的电生理转运蛋白从细胞内的膜,并在药物发现的,因为它的稳健性和自动化潜力的筛选应用是有吸引力的。
SSM-basedUsing传统的电,时间分辨表征运输orters是具有挑战性的。由于营业额转运低巨型补丁“或”全细胞“配置是必需的,其中有一个固有的低时间分辨率的解决方案交换实验。并发症是可以克服的使用光解基板释放。然而,只有有限数目的衬底都适合于这种方法。在这里,快速地解决在SSM交流提供了独特的机会,使用任意基板具有很高的时间分辨率进行电生理研究。
2。限制和关键步骤
在膜片钳和电压钳技术相比,基于SSM算法的电不能被用于施加电势。转运特性,因此仅限于运输模式不依赖于膜电位。
在一般情况下,基于SSM的电生理学有不同的(生电)转运没有限制。但电压CL放大器或膜片钳方法可以有优势,如果细胞内的组件,如结合蛋白所需要的蛋白质的功能。
限制可能会出现,如果解决方案交换创建大神器电流。发生这种情况时,基板与的SSM像亲脂性化合物的情况下强相互作用。工件控件,可用于修正测量出的信号。此外,高的盐,背景在所有测量的缓冲区可以被用来减少工件。但在情况下,工件的大小是可比较的蛋白质信号,它几乎是不可能的,从工件分离蛋白相关信号。幸运的是,高文物是不寻常的,优化的解决方案交换。
有几个成功地实现了一个基于SSM的电生理实验的关键步骤。蛋白质样品的准备是最重要的部分。如果脂蛋白体使用,确保重建titution过程产生清洁,可再现的样本足够LPR和转运为导向以正确的方式。的LPR可以检查冷冻断裂电子显微镜和方向,如果抗体可通过酶联免疫吸附实验。
只使用SSM孵化蛋白质样品的最佳参数。蛋白质的注入是另一个关键的一步。超声处理是必不可少的,在注射过程中,应避免气泡。样品孵化后的测量本身是至关重要的,因为气泡会从传感器芯片除去吸附的蛋白质样品。因此,应始终去除气泡,改变后的解决方案。不过信号破败可能发生。要纠正一个可能的信号断开,这是必不可少的在实验过程中,以完成破旧控制的。
3。专业系统
SSM设置可以根据其应用修改。此外吨这里是完全不同的,高度专业化的设置。
是不对称的条件下, 例如 pH梯度下的可能性来衡量蛋白质信号。要建立内部和外部的蛋白脂质体的第三解决方案的不对称的缓冲组合物,静息的解决方案,已被引入,这需要一个双交换配置。在这里,非活化和休息的解决方案之间的一个额外的三通阀的切换是必需的。
为了增加系统的时间分辨率,我们开发了一种替代缺乏终端阀,但使用不同的不同的比色皿的流动通路。这里激活和非激活溶液的交界处比色皿内,位于前面的SSM 3毫米。这种设置非常适合于快速运输过程动力学分析。低至2毫秒的时间分辨率,可以显示。
商业f来自ully自动化系统旨在用于药物筛选的一个显着更高的吞吐量。一种可移动单元收集的解决方案,而且将它们注射到传感器表面,在96孔板中在一个标准的微量滴定板的格式。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢J.加西亚塞尔马,我斯米尔诺娃和R. Kaback的贡献拉齐测量和E班贝格的支持和有益的讨论。
Materials | |||
Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
O-rings | Seal Science Inc. | ||
Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Amplifier | Keithley | 427 | |
Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
Regeants | |||
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |