전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

1. SSM 기반의 전기 생리학에 대한 장치 설정 자세한 내용은 개략적 도면과 우리 큐벳의 사진을 포함하고 1, 2를 설정 우리의 기술 발행물의 두 가지에있다. 다른 솔루션 교환 구성과 흐름 프로토콜은 또한 우리의 방법 종이 2에 설명되어 있습니다. 다음에서 우리는 몇 가지 최근의 개선 및 비디오 프레 젠 테이션을위한 직접적인 관련이없는 기술적 인 세부 사항을 추가합니다. 밸브 제어 및 데이터 수집 인터페이스 박스는 상용 USB 디지털 출력 / 아날로그 입력 인터페이스 (NI USB 6009 내쇼날 인스트루먼트)와 밸브 드라이버가 포함되어 있습니다. 이 솔루션의 흐름을 제어 및 데이터 수집을 담당하고 있습니다. 밸브는 일반적으로 빠른 밸브 18까지의 전압으로 구동 V. 비디오에서 우리는 12 V 전원 공급 장치를 사용 할 수있는 스위칭, 그러나 12으로 구동 V. 있습니다. </P> 밸브 드라이버 회로 보드는 4 개의 밸브를 조작 할 수 있습니다. 그것은 생물 물리학의 맥스 플랑크 연구소의 공장에서 제조되었다. 밸브는 전면 패널 스위치를 통해 컴퓨터 또는 수동으로 제어 할 수 있습니다. 후자는 청소 – 절차 및 플러시 편리합니다. 측정하는 동안, 인터페이스 박스는 밸브 제어 및 데이터 수집 소프트웨어 (SURFE 2 R 소프트웨어 IonGate 생명 과학)를 사용하여 컴퓨터 제어됩니다. 2. 준비 이 섹션에서는 SSM 기반의 전기 생리학 실험의 준비를위한 다양한 프로토콜이 언급되어 있습니다. 2.1 SSM의 형성 지질 솔루션 만들기 25 μL Octadecylamine (클로로포름 5 MG / ML)와 GLAS 유리 병에 375 μL Diphytanoylphosphatidylcholine을 (클로로포름 20 MG / ML) 섞는다. 회전 증발기 및 지속적인 질소 가스 유량 사용에 대한 클로로포름을 증발약 30 분. N-데칸의 500 μL로 흔들어 유리 병의 벽에서 지질을 제거합니다. 최종 지질 농도 1:60 (W / W) octadecylamine와 15 MG / ML입니다. 유리 저장 병에 대한 해결책을 전송합니다. -20 ° C.에서 지질 솔루션을 저장 기준 전극의 2.2 염소화 참조 전극 마모로 인해 일정한 간격으로 염화해야합니다. 염소 처리하기 전에 잘 사포를 사용하여 이전 silverchloride 층의 나머지 부분을 제거합니다. 1 M 염산 용액에 백금 전극과 함께 실버 와이어를 배치하고 0.5 mA에서 15 분간 chlorinate. 염소를 완료 한 후, 실버 와이어는 균일 한 어두운 회색 색상을 변경합니다. 폴리 아크릴 아마이드 젤 다리 2.3 준비 100 mM의 pH에​​서 KPI = 7, 100 mM의 KCl을 6를 포함하는 솔루션을 준비합니다%의 아크릴 아미드. 0.3 % APS (10 % 주식)을 추가하고 0.6 %는 TEMED 곧 피펫 솔루션을 섞는다. 즉시 용액을 혼합 한 후, 빈 젤 다리 용기에 혼합물의 30 μl를 주입 피펫을 사용합니다. 그것은 주입시 공기 방울을 방지하는 것이 중요합니다. 20 분의 배양 시간 동안 젤 중합. 중합 후 젤 다리 용액 (100 mM의 KPI pH가 7, 100 mM의 KCl을)에 저장됩니다. 젤 다리의 수명을 연장하기 위해 솔루션은 4 ° C.에 저장됩니다 측정 솔루션 2.4 준비 다른 구성의 솔루션을 교환 할 때 SSM과 용질의 강한 상호 작용으로 인해, 전기 아티팩트가 생성됩니다. 따라서 솔루션의 준비는 중요한 단계입니다. 솔루션 교환 아티팩트를 최소화하기 위해 솔루션의 준비 과정에서 다음과 같은 예방 조치를 취하십시오. 비 활성화하고 하나의 일괄 처리에서 솔루션을 활성화합니다, pH와 이온 강도를 조정합니다. 높은 소금 배경 솔루션 교환 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 두 개의 볼륨으로 배치 솔루션을 나눕니다. 활성화 용액에 활성 화합물을 추가합니다. 가능한 한 유사한으로 삼투압과 두 솔루션의 이온 강도를 유지하기 위해 비 활성화 솔루션의 보상 화합물을 사용합니다. 솔루션은 4 ° C에 저장되어있는 경우, 온도도 작은 차이가 아티팩트를 생성 할 수 있기 때문에 모든 솔루션은 측정을 시작하기 전에 실내 온도에 도달해야합니다. 3. SSM 기반의 전기 생리학 실험 여기에서 우리는 SSM 기반의 전기 생리학 실험에 대한 일반적인 프로토콜을 제시한다. 3.1 SSM 설치 준비 SSM 설치를 사용하지 않을 때에는 튜브는 30 % 에탄올로 가득/ 물 솔루션 박테리아의 성장을 방지 할 수 있습니다. 큐벳을 설치하기 전에 튜브에서 에탄올을 제거하는 순수한 물 시스템을 씻으십시오. 물 컨테이너 에탄올 용기를 교체합니다. 높은 압력 (0.6-1.0 bar)를 물 20 ~ 30 ml의 시스템을 청소 사용. pH를 7.6 또는 비 활성화 솔루션을 100 mM의 KPI 버퍼를 사용하여 청소 절차를 반복합니다. 기포가 유체 시스템에 남아 있는지 확인합니다. 3.2 큐벳 장착 기준 전극에 O-링을 부착 스토리지 솔루션에서 젤 다리를 타고와 기준 전극을 연결합니다. 미리 기입 비 활성화 버퍼 콘센트 커넥터, O-링을 삽입하고 기준 전극 어셈블리를 완료하는 젤 다리를 연결합니다. 기포가 젤 다리와 출구 용액 흐름 경로의 교차점에 없는지 특별한주의를 기울입니다. cuve의 주요 부분을 Preassemble스프링 접촉 핀 (앰프에 연결), 유입 관 (터미널 밸브에 연결), O-링 (SSM에 대한 밀봉)하고 나사를 추가하여 테. 핀셋 사용하여 저장 용액 (에탄올 10 MM의 octadecanethiol)의 센서 칩을 꺼내. 피펫을 사용하여, 약에 남아있는 솔루션을 씻어. 순수 에탄올 5 ㎖. 질소 가스 하에서 전극을 건조. 입구 큐벳의 주요 부분의 구멍 수 있도록 큐벳의 기본 부분에 정확하게 센서 칩을 배치하는 것은 센서의 원형 활성 영역으로 전달됩니다. 센서 칩의 활성 영역 지질 용액 1 μL를 추가합니다. 금 층이 완전히 지질에 포함되어 있는지, 확인하십시오. 바로 지질의 솔루션을 추가 한 후, 미리 조립 된 주요 부분을 추가하여 큐벳을 닫습니다. 패러데이 케이지에 큐벳을 설치하기 전에 모든 표면이 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. CONN터미널 밸브 스프링 접촉 핀과 입구 튜브 앰프 요법. 다음 패러데이 케이지 안에 나사 큐벳을 수정합니다. 큐벳의 상단에 콘센트 커넥터를 고정합니다. 마지막으로 콘센트 커넥터와 기준 전극에 전압 발생기 출구 튜브를 연결합니다. 즉시 설치 후 큐벳 0.6 바에서 버퍼 시스템을 씻는다. 이 자연 SSM 형성에 이르게한다. 3.3 측정 막 매개 변수 SSM의 품질을 확인하려면, 정전 용량 및 전도는 함수 발생기를 사용하여 측정하고 있습니다. 함수 발생기 사용하여 전도도를 측정하기 위해 mV에서 100 mV DC 전압을 적용합니다. 컨덕턴스를 계산 : 현재 붕괴 막 커패시터의 충전을 보여줍니다. 커패시터 후 완전히 측정 된 현재의 수익률에게 옴의 법칙을 사용하여 막 전도도가 청구됩니다. 단순함을 위해 우리는 CU를 사용rrent 1 초는 전압 후 전기 전도도 G = I / U.를 적용하여 산정 진폭과 커패시턴스를 측정하는 0.5 Hz의 주파수에서 최대 50 MV 피크 삼각형 AC 전압을 적용합니다. 용량 계산 결과 구형파 전류의 진폭은 커패시터의 충전 전류를 나타냅니다. 정전 용량 C는 전송 요금 같다 Q = ΔU = mV에서 100 mV로 나누어 IΔt. (나는 삼각형 전압의 차이가 현재의 긍정적 인 마이너스 음의 기울기이므로 ΔU 두 번 50 MV의인가 전압이다.) 반복적으로 막 약마다 10 분의 전기적 매개 변수를 모니터링 할 수 있습니다. 상수 값에 도달 할 때까지 30 ~ 40 분. 1-0.6에 대한 막대의 범위에서 높은 압력에서 KPI 버퍼와의 사이에 씻으십시오. SSM의 품질을 추정 : 최적의 매개 변수는 0.1-0.2 nS는 및 2-3.5 NF의 범위에 있습니다. 1 NF 아래 0.8 nS는 낮은 커패시턴스 위의 높은 전도성을 나타냅니다SSM이 제대로 형성되지 않습니다. 4 NF 위의 높은 용량은 활성 영역이 SSM에 의해 완전히 적용되지 않는 것을 의미합니다. 매개 변수가 최적의 범위 내에 있지 않은 경우, 멤브레인은 폐기되어야하며 다른 SSM은 갓 준비된 전극 칩을 사용하여, 준비. 솔루션 교환 아티팩트 3.4 검사 막 매개 변수를 검사 한 후, 측정 버퍼 용액 교환 유물에 대한 검사를해야한다. 유체 시스템에 각각의 솔루션 컨테이너를 삽입합니다. 수동 밸브를 사용하여 유체 시스템에서 공기 방울을 제거합니다. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하면 실험에 사용할 흐름 프로토콜을 선택했다. 0.6 bar까지 압력을 조정하고 측정을 시작합니다. 떨어져 기계적 밸브 스위칭 유물에서 이상적으로 어떤 이슈 전류는 측정하지 않아야하거나 훨씬 SMA해야한다예상 단백질 교통 신호보다 ller의. 솔루션 교환 유물이 발견되면, 실험을 계속하기 전에 버퍼 조성물 및 / 또는 준비 절차를 최적화하려고합니다. 3.5 단백질 샘플을 추가 보통 proteoliposomes 또는 막 조각은 -80에서 냉동 저장됩니다 ° C.는 하나의 측정을 위해 약 30 μL의 나누어지는이 필요합니다. 비 활성화 솔루션 SSM을 씻어. 얼음에 단백질 샘플을 해동. 세 개의 10 초 초음파주기 얼음에 10 초 냉각 간격으로 교대된다. Proteoliposomes는 목욕 sonicator를 사용하여 초음파됩니다. 막 조각을위한 팁 sonicator이 (50W, 30 kHz에서 1 밀리미터 sonotrode 직경, 강도 20 %, 사이클 0.5)이 사용됩니다. 마지막 초음파 단계 후 얼음에 다시 샘플을 두지 않지만, 큐벳에 즉시 투입. 풀고 콘센트는 참조 전극 ASSE와 함께 커넥터를mbly. 피펫을 사용하여 단백질 시료 30 μl를 대기음 구멍 콘센트에 피펫 팁을 탑재. 폐기물 컨테이너에 비 활성화 경로에 수동 밸브를 열고 큐벳 볼륨으로 proteoliposomes을 주입. 센서 큐벳 볼륨으로 공기를 주입하지 않도록주의하십시오. 피펫 팁을 제거하기 전에, 추가 솔루션의 흐름을 방지하기 위해 수동 밸브를 닫습니다. proteoliposomes 1 ~ 2 시간의 배양 시간 동안 SSM에 흡착 할 수 있습니다. 그것은 하룻밤 배양하는 것도 가능합니다. SSM 기반 실험의 3.6 일반 절차 4 ° C.에 저장하는 경우에, 시간 측정 버퍼를 따뜻하게 모든 측정 버퍼 유물을 피하기 위해 측정을 시작하기 전에 실내 온도에 있어야합니다. 솔루션을 변경하는 경우, 먼저 비 퍼징 조직으로 솔루션 컨테이너 내부에 튜브를 청소 한 다음 새 병을 삽입합니다. 측정을 시작하기 전에, 변경 절차에서 진화 할 수 기포를 제거하기 위해 수동 밸브를 사용합니다. 그냥 측정을 시작하기 전에 압력을 조정합니다. 우리는 정기적으로 우리의 특정 밸브와 튜브 구성이 약 1.0 ML / 초 유량을 산출 0.6 바의 압력을 사용합니다. 처음 몇 측정은 다른 후 바로 하나를 수행 할 수 있으며, 피크 전류가 일정하게 유지 될 때까지 거부해야한다. 솔루션은 pH가 다른 경우 적어도 3 분의 배양 시간은 측정을 시작하기 전에 proteoliposomes의 내부 산도를 조정하기 위해 필요합니다. 이제 세트까지 측정을위한 준비가되어 있습니다. 소음을 줄이기 위해 최소 3 측정이 이루어과 평균해야한다. 3.7 제어 측정 일련의 측정 중 신호 런은 단백질 분해 또는 흡착 손실로 인해 발생할 수 있습니다. 각각의 SSM 실험 내가해야런 컨트롤을 NCLUDE. 이 동일한 솔루션을 반복 측정하여 수행됩니다. 최소 런 컨트롤은 동일한 솔루션을 사용하여, 하나의 시작 부분에 측정하고 실험의 끝을 의미합니다. 우리는 당신이 실험에서 가장 높은 피크 진폭을 기대 조건 런 제어를 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게하면 신호의 개요를 정량화 할 수 있습니다. 신호 런은 두 개요 컨트롤의 피크 진폭의 비교에 의해 정량화 할 수있다. 결과 백분율 값은 런의 선형 시간 의존성을 가정하여 측정 된 신호를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 3.8 아티팩트 컨트롤 가능하면 실험 후 관심 억제 단백질에 의해 결과를 확인하려고합니다. 나머지 신호는 아마도 솔루션 교환 유물이다. 신호는 측정 된 이슈를 수정해야합니다. <p c실험 후 아가씨 = "jove_step"> 3.9 순수한 물 20 ~ 30 mL를 30 % 에탄올 / 물 20 ~ 30 ml의 시스템을 씻으십시오. 시스템을 사용하지 않을 때 에탄올 용액은 박테리아의 성장을 방지합니다. 이 세척 과정을 거친 후, 시스템에서 압력을 해제하고 모든 기기의 전원을 끄십시오. 패러데이 케이지에서 큐벳을 제거하고 분리. 큐벳의 모든 부분은 목욕 sonicator를 사용하여 필요한 경우, 물과 순수 에탄올로 세척 할 수 있습니다. 순수 에탄올 GLAS 비커에 센서 칩을 놓습니다. 목욕 sonicator를 사용하여 약 1 ~ 2 분 비커를 초음파 처리. 질소 가스 하에서 센서 칩을 말린다. 10 MM Octadecanthiol 에탄올 용액에 빛으로부터 멀리 센서 칩을 저장합니다. 약 30 분 배양 시간 이후 센서 칩은 재사용을위한 준비가되어 있습니다.