Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

Estudos recentes demonstraram células imunes consideráveis, e especificamente células B, heterogeneidade fenotípica e funcional, dependendo da localização celular^{1,,2,,3,,4,,5}. As células B-1a são uma dessas populações com capacidade heterogênea de produzir anticorpos IgM protetores; as células B-1a da medula óssea secretam O IgM de forma constitutiva e contribuem significativamente para os títulos de IgM plasmático⁶, enquanto as células peritoneal B-1a têm secreção IgM de baixo nível na homeostase e, em vez disso, podem ser ativadas através de receptor inata semelhante ao pedágio (TLR) ou sinalização mediada por citocinas para proliferar rapidamente, migrar e segregar IgM^7,8,9,10. Os anticorpos IgM de células B-1a reconhecem epítopos específicos de oxidação (OSE) presentes em patógenos, células apoptóticas e LDL oxidado, e a ligação IgM à OSE pode prevenir a sinalização inflamatória a jusante em doenças como aterosclerose¹¹. Portanto, estratégias para aumentar a produção de IgM através do aumento da migração de células peritoneal B-1a para locais como a medula óssea podem ser terapeuticamente úteis. No entanto, é importante que tais estratégias sejam direcionadas e específicas do tipo celular, pois efeitos fora do alvo podem impactar negativamente a função imunológica ou a saúde.

Aqui descrevemos um método de superexpressão direcionada e de longo prazo do CXCR4 em células murinas primárias B-1a e posterior transferência adotiva para visualizar a migração celular e a produção funcional de anticorpos IgM(Figura 1). A manipulação genética das células B primárias é limitada por baixas eficiências de transfecção em comparação com a transfecção de linhas celulares transformadas. No entanto, como as linhas celulares transformadas podem se desviar significativamente das células primárias^12,13, o uso de células primárias provavelmente fornecerá resultados que se alinham mais à fisiologia normal. Várias técnicas foram descritas para transferência genética em células murinas primárias B, incluindo transdução retroviral, transdução adenoviral, lipofecção ou transfecção à base de eletroporação, que têm diferentes níveis de eficiência, transitoriedade e impacto na saúde celular^13,,14,,15. O método a seguir utilizou a transdução retroviral, pois produziu eficiência adequada de transferência genética de >30% ao mesmo tempo em que impactou minimamente a viabilidade celular. O retrovírus expresso em CXCR4 foi gerado usando o retroviral descrito anteriormente pelo vírus da célula-tronco murina-proteína fluorescente ribossômica (MSCV-IRES-GFP); MigR1)¹⁶, no qual o gene CXCR4 do mouse foi subsla clonado⁴. As partículas retrovirais MigR1 (controle(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP foram geradas usando transfecção fosfato de cálcio, conforme descrito nos protocolos publicados anteriormente^4,,14.

As células B-1a transduzidas com sucesso foram então transferidas por via intravenosa para rag1 deficiente de linfócitos^./- camundongos. Ambos os camundongos doadores e receptores também continham o nocaute do gene apolipoproteína E (ApoE), que resulta em aumento do acúmulo de OSE e aterosclerose, fornecendo assim um modelo para ativação celular In vivo B-1 e produção de IgM. Além disso, os camundongos doadores e receptores diferem no aótipo CD45; as células B-1 doadoras vieram de cd45.1+ ApoE^-/- camundongos e foram transferidas para rag1^-/- CD45.2+ ApoE^-/- receptores. Isso permitiu a diferenciação do CD45.1 do doador das células CD45.2 B receptoras após a transferência sem a necessidade de coloração adicional para marcadores de células B durante a análise da citometria de fluxo. Os resultados aqui fornecidos demonstram que a superexpressão CXCR4 direcionada em células B-1a associa-se ao aumento da capacidade das células B-1a de migrar para a medula óssea, que se associa ao aumento do plasma anti-OSE IgM. Além disso, fornecemos um método para o enriquecimento de células Peritoneal B-1 através da seleção negativa e demonstramos a exigência de ativação celular B-1 para transdução eficiente. Este método pode ser adaptado para outros construtos retrovirais para estudar o efeito da superexpressão proteica na migração celular B-1a, fenótipo ou função. Além disso, o uso da distinção de alótipo CD45.1 versus CD45.2 poderia teoricamente permitir a transferência para outros modelos míopes imunes que contenham células B endógenas.