Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

Recenti studi hanno dimostrato una notevole cellula immunitaria, e in particolare cellule B, fenotipica e eterogeneità funzionale a seconda della localizzazione cellulare^1,2,3,4,5. Le cellule B-1a sono una di queste popolazioni con capacità eterogenea di produrre anticorpi IgM protettivi; Le cellule del midollo osseo B-1a secernono IgM in modo costitutivo e contribuiscono in modo significativo al plasma IgM titers⁶, mentre le cellule peritoneali B-1a hanno una secrezione IgM di basso livello all’omeostasi e possono invece essere attivate attraverso il recettore innato del toll-like (TLR) o la segnalazione di citokine mediata a proliferare rapidamente, migrare, e secernere IgM^7,8,9,10. Gli anticorpi IgM delle cellule B-1a riconoscono gli epitopi specifici dell’ossidazione (OSE) presenti su patogeni, cellule apoptotiche e LDL ossidati, e il legame IgM all’OSE possono prevenire la segnalazione a valle in malattie come l’aterosclerosi infiammatoria¹¹. Pertanto, le strategie per aumentare la produzione di IgM attraverso l’aumento della migrazione cellulare B-1a peritoneale a siti come il midollo osseo possono essere terapeuticamente utili. Tuttavia, è importante che tali strategie siano mirate e specifiche del tipo di cellula, poiché gli effetti off-target possono avere un impatto negativo sulla funzione o sulla salute del sistema immunitario.

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione mirata e a lungo termine di CXCR4 nelle cellule primarie murine B-1a e il successivo trasferimento adottivo per visualizzare la migrazione delle cellule e la produzione funzionale di anticorpi IgM (Figura 1). La manipolazione genetica delle cellule B primarie è limitata da basse efficienze di trasfezione rispetto alla trasfezione di linee cellulari trasformate. Tuttavia, poiché le linee cellulari trasformate possono deviare significativamente dalle cellule primarie^12,13, è probabile che l’uso di cellule primarie fornisca risultati più strettamente allineati alla fisiologia normale. Sono state descritte diverse tecniche per il trasferimento genico nelle cellule primarie del murino B, tra cui trasduzione retrovirale, trasduzione adenovirale, lipofezione o trasfezione basata sull’elettroporazione, che hanno diversi livelli di efficienza, transitorietà e impatto sulla salute cellulare^13,14,15. Il seguente metodo ha utilizzato la trasduzione retrovirale in quanto ha prodotto un’adeguata efficienza di trasferimento genico di >30%, con un impatto minimo sulla vitalità cellulare. Il retrovirus espresso CXCR4 è stato generato utilizzando il costrutto retrovirale descritto in precedenza per il virus della cellula staminale murine, l’ingresso interno del sito-proteina fluorescente verde (MSCV-IRES-GFP; MigR1)¹⁶, in cui il gene CXCR4 del topo era sub-clonato⁴. Le particelle retrovirali MigR1 (control(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP sono state generate utilizzando la trasfezione di fosfato di calcio, come descritto nei protocolli pubblicati in precedenza^4,14.

Le cellule B-1a trasdotte con successo sono state poi trasferite per via endovenosa nei topi Rag1^{-/-mitragliati} carenti di linfocite. Sia i topi donatori che quelli riceventi contenevano inoltre l’eliminazione del gene dell’apolipoproteina E (ApoE), che si traduce in un aumento dell’accumulo di OSE e dell’aterosclerosi, fornendo così un modello per l’attivazione cellulare B-1 in vivo e la produzione di IgM. Inoltre, i topi donatori e ricittori differivano nell’allotipo CD45; Le cellule del donatore B-1 provenivano da^topi CD45.1 e sono stati trasferiti nei^destinatari Rag1^-/- CD45.2. Ciò ha permesso la differenziazione del donatore CD45.1 dalle cellule CD45.2 B del ricevente dopo il trasferimento senza la necessità di macchiare ulteriormente i marcatori di cellule B durante l’analisi della citometria di flusso. I risultati forniti qui dimostrano che la sovraespressione mirata di CXCR4 sulle cellule B-1a si associa alla maggiore capacità delle cellule B-1a di migrare verso il midollo osseo, che associa a un aumento del plasma anti-OSE IgM. Forniamo inoltre un metodo per l’arricchimento delle cellule B-1 peritoneali attraverso la selezione negativa e dimostriamo il requisito dell’attivazione delle cellule B-1 per una trasduzione efficiente. Questo metodo può essere adattato per altri costrutti retrovirali per studiare l’effetto della sovraespressione proteica sulla migrazione, sul fenotipo o sulla funzione delle cellule B-1a. Inoltre, l’uso della distinzione di allotipo CD45.1 rispetto a CD45.2 potrebbe teoricamente consentire il trasferimento in altri modelli murini immunosufficienti contenenti cellule B endogene.