الرجعية Overexpression من CXCR4 على الخلايا B-1a مورين والنقل بالتبني للهجرة الخلايا B-1a المستهدفة إلى نخاع العظام وإنتاج IgM
Summary
هنا نصف طريقة لفرط في التعبير الرجعية ونقل بالتبني من الخلايا B-1a المورين لفحص في حالة انتقال الخلية B-1a والتعريب. يمكن تمديد هذا البروتوكول للمقالات الوظيفية المتنوعة في المصب بما في ذلك التحديد الكمي لتوطين الخلايا B-1a المانحة أو تحليل العوامل المفرزة المشتقة من الخلايا المانحة بعد النقل بالتبني.
Abstract
كما تتأثر وظيفة الخلية بعوامل متخصصة في البيئة الدقيقة الخلوية، وطرق تشريح توطين الخلية والترحيل يمكن أن توفر المزيد من البصيرة على وظيفة الخلية. الخلايا B-1a هي مجموعة فرعية فريدة من نوعها خلية B في الفئران التي تنتج الأجسام المضادة IgM الطبيعية الواقية ضد epitopes الأكسدة الخاصة التي تنشأ أثناء الصحة والمرض. B-1a إنتاج الخلية IgM يختلف اعتمادا على موقع الخلية B-1a، وبالتالي يصبح من المفيد من وجهة نظر علاجية لاستهداف B-1a التعريب إلى منافذ داعمة لإنتاج الأجسام المضادة عالية. هنا نحن وصف طريقة لاستهداف هجرة الخلايا B-1a إلى نخاع العظام عن طريق التعبير المفرط بوساطة الرجعية من مستقبلات كيموكين زفكرة C-X-C 4 (CXCR4). يمكن أن يكون تحريض الجينات في خلايا المورين B الأولية تحديًا وعادةما ينتج كفاءة نقل منخفضة بنسبة 10-20٪ اعتمادًا على التقنية. هنا نثبت أن نقل الفيروس الرجعي من الخلايا الأولية B-1a الخلايا يؤدي إلى 30-40٪ كفاءة نقل. تستخدم هذه الطريقة نقل الخلايا بالتبني للخلايا B-1a المستحثة إلى فئران متلقية ناقصة الخلية B بحيث يمكن تصور ترحيل الخلايا B-1a وتوطينها. يمكن تعديل هذا البروتوكول لبنيات أخرى من الفيروسات الرجعية ويمكن استخدامها في المقالات الوظيفية المتنوعة بعد نقل بالتبني، بما في ذلك تحليل الخلية المانحة أو الخلية المضيفة فيلوب ووظيفة، أو تحليل العوامل القابلة للذوبان تفرز بعد نقل الخلية B-1a. كما أن استخدام فئران مانحة ومتلقية متميزة متمايزة بواسطة CD45.1 وCD45.2 allotype ووجود مراسل GFP داخل البلازميد الرجعي يمكن أن يمكّن أيضًا من الكشف عن الخلايا المانحة في نماذج فأرة أخرى كافية للمناعة تحتوي على مجموعات خلايا B داخلية.
Introduction
وقد أظهرت الدراسات الحديثة خلايا مناعية كبيرة، وتحديدا خلية B، التغايرية الفينوتيرية والوظيفية اعتمادا على توطين الخلايا1،,2،,3،,4،,5. الخلايا B-1a هي واحدة من هذه السكان مع القدرة غير المتجانسة لإنتاج الأجسام المضادة IgM واقية; نخاع العظم B-1a الخلايا إفراز IgM التأسيسية والمساهمة بشكل كبير في البلازما IgM titers6, في حين أن خلايا ب-1a بب ذات مستوى منخفض إفراز IgM في التوازن بدلا من ذلك يمكن تفعيلها من خلال مستقبلات مثل حصيلة فطرية (TLR) أو السيتوكين بوساطة إشارة إلى الانتشار السريع, الهجرة, وإفراز IgM7,,8,,9,,10. B-1a الخلية IgM الأجسام المضادة التعرف على epitopes الأكسدة محددة (OSE) التي هي موجودة على مسببات الأمراض, الخلايا المبرمجة, وLDL مؤكسد, وIgM ملزمة لOSE يمكن منع إشارات المصب الالتهابي في أمراض مثل تصلب الشرايين11. لذلك ، قد تكون استراتيجيات زيادة إنتاج IgM عن طريق زيادة هجرة الخلايا B-1a الجبقية إلى مواقع مثل نخاع العظم مفيدة علاجيًا. ومع ذلك، من المهم أن تكون هذه الاستراتيجيات مستهدفة ومحددة من نوع الخلية، حيث أن الآثار غير المستهدفة قد تؤثر سلبًا على وظيفة المناعة أو الصحة.
هنا نحن وصف طريقة لموجه وطويلة الأجل overexpression CXCR4 في الخلايا الأولية B-1a murine ونقل بالتبني اللاحقة لتصور هجرة الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة IgM وظيفية(الشكل 1). ويكون التلاعب الجيني بالخلايا B الأولية محدودًا بسبب انخفاض كفاءة التَلَقمقارنة بمعالجة خطوط الخلايا المتحولة. ومع ذلك ، كما خطوط الخلايا المحولة يمكن أن تحيد بشكل كبير عن الخلايا الأولية12،13، واستخدام الخلايا الأولية من المرجح أن توفر النتائج التي تتماشى بشكل وثيق مع علم وظائف الأعضاء العادية. وقد وصفت عدة تقنيات لنقل الجينات في الخلايا الأولية المورين باء, بما في ذلك نقل الفيروس الرجعي, نقل الغدي الفيروسي, lipofection, أو التسفير القائم على الكهربية, التي لديها مستويات متفاوتة من الكفاءة, انتقال, وتأثير على صحة الخلايا13,,14,,15. استخدمت الطريقة التالية نقل الفيروس الرجعي لأنها أسفرت عن كفاءة كافية لنقل الجينات بنسبة > 30٪ في حين تؤثر على الحد الأدنى من صلاحية الخلية. تم إنشاء الفيروس الرجعي CXCR4 المعبر عنه باستخدام الفيروس الرجعي الموصوف سابقًا بناء فيروس الخلايا الجذعية المورينداخلي -بروتين الفلورسنت الأخضر (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, التي كان الماوس CXCR4 الجين الفرعي المستنسخة4. تم إنشاء MigR1 (التحكم (Ctl)-GFP) وجزيئات الرجعية CXCR4-GFP باستخدام التفسفات فوسفات الكالسيوم كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا4,14.
تم نقل الخلايا B-1a التي تم نقلها بنجاح عن طريق الوريد إلى Rag1-/- الفئران التي تعاني من نقص الخلايا الليمفاوية. بالإضافة إلى ذلك، احتوت الفئران المانحة والمتلقية بالضربة القاضية لمورثة apolipoprotein E (ApoE) ، مما يؤدي إلى زيادة تراكم OSE وتصلب الشرايين ، مما يوفر نموذجًا لتنشيط الخلية B-1 في الجسم الحي وإنتاج IgM. وعلاوة على ذلك، اختلفت الفئران المانحة والمتلقية في النمط الكلووي CD45؛ جاءت الخلايا B-1 المانحة من CD45.1+ ApoE-/- الفئران وتم نقلها إلى Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-المستلمين. سمح هذا التمايز من المانح CD45.1 من المتلقي CD45.2 B الخلايا بعد النقل دون الحاجة إلى وصمة عار بالإضافة إلى علامات الخلية B أثناء تحليل قياس الخلايا التدفق. النتائج المقدمة هنا تثبت أن الهدف CXCR4 الإفراط في التعبير على الخلايا B-1a المنتسبين مع زيادة قدرة الخلايا B-1a على الهجرة إلى نخاع العظام، الذي يرتبط مع زيادة البلازما المضادة OSE IgM. نحن نقدم بالإضافة إلى ذلك طريقة لتخصيب خلايا ب-1 ب الجهوية من خلال الاختيار السلبي وإظهار متطلبات تنشيط الخلية B-1 من أجل نقل فعال. يمكن تكييف هذه الطريقة لبنيات أخرى رجعية لدراسة تأثير الإفراط في التعبير البروتيني على هجرة الخلايا B-1a أو النمط الظاهري أو الوظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام CD45.1 مقابل CD45.2 التمييز allotype يمكن أن تسمح نظريا ً بالانتقال إلى نماذج أخرى كافية من التورين المناعي تحتوي على خلايا B ذاتية المنشأ.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المقدمة هنا تمكن مستقرة وفعالة نسبيا الأولية B-1a تسليم الجينات الخلية، في نقل العضوية على جهاز الحي، وتحديد وتوطين الخلايا المحقونة. وتمكنت الخلايا من الكشف عن 17 أسبوعا ً من نقل هاون الخلية واحتفظت بزيادة تعبير CXCR4. أدى التسليم بوساطة الفيروسات الرجعية 30-40٪ كفاءة نقل الخلايا الأول?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل 1R01 HL107490 ، 1R01 HL136098 ، المشروع 3 من P01 HL055798 ، P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) ، وR01GM100776 (T.P. Bender). أ. بدعم من جمعية القلب الأمريكية قبل الدكتوراه زمالة 16PRE30300002 و 5T32AI007496-20. نشكر جوان لاننيغان، مايك سولغا، وكلود تشو من جامعة فرجينيا تدفق القلب للخلايا على مساعدتهم التقنية الممتازة.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
Riferimenti
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
