Summary

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Published: May 31, 2020
doi:

Summary

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Abstract

Aangezien de celfunctie wordt beïnvloed door nichespecifieke factoren in de cellulaire micro-omgeving, kunnen methoden om cellokalisatie en migratie te ontleden, verder inzicht geven in de celfunctie. B-1a cellen zijn een unieke B-cel subset in muizen die beschermende natuurlijke IgM antilichamen produceren tegen oxidatie-specifieke epitopen die ontstaan tijdens de gezondheid en ziekte. B-1a cel IgM productie verschilt afhankelijk van B-1a cel locatie, en daarom wordt het nuttig vanuit een therapeutisch oogpunt te richten B-1a lokalisatie niches ondersteunen van hoge antilichaam productie. Hier beschrijven we een methode om B-1a celmigratie naar het beenmerg te richten door retrovirale gemedieerde overexpressie van het C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninductie in primaire murine B-cellen kan uitdagend zijn en levert meestal lage transfectie-efficiëntie van 10-20% op, afhankelijk van de techniek. Hier tonen we aan dat retrovirale transductie van primaire murine B-1a cellen resulteert in 30-40% transductie-efficiëntie. Deze methode maakt gebruik van adoptieceloverdracht van getransduceerde B-1a cellen in B-cel-deficiënte ontvangende muizen, zodat donor B-1a celmigratie en lokalisatie kan worden gevisualiseerd. Dit protocol kan worden gewijzigd voor andere retrovirale constructies en kan worden gebruikt in diverse functionele tests post-adoptieve overdracht, met inbegrip van analyse van donorcel of gastheer cel fenotype en functie, of analyse van oplosbare factoren afgescheiden post B-1a cel overdracht. Het gebruik van verschillende donor- en ontvangermuizen, onderscheiden door CD45.1 en CD45.2-allotype en de aanwezigheid van een GFP-verslaggever binnen het retrovirale plasmide, zou ook de detectie van donorcellen in andere, immuun-toereikende muismodellen met endogene B-celpopulaties mogelijk kunnen maken.

Introduction

Recente studies hebben aangetoond aanzienlijke immuuncel, en met name B-cel, fenotypische en functionele heterogeniteit, afhankelijk van cellokalisatie1,2,3,4,5. B-1a cellen zijn een dergelijke populatie met heterogene capaciteit om beschermende IgM-antilichamen te produceren; beenmerg B-1a cellen scheiden IgM constitutief en dragen aanzienlijk bij aan plasma IgM titers6, terwijl peritoneale B-1a cellen hebben low-level IgM secretie op homeostase en in plaats daarvan kan worden geactiveerd door aangeboren tol-achtige receptor (TLR) of cytokine-gemedieerde signalering om snel te vermenigvuldigen, migreren en scheiden IgM7,8,9,10. B-1a-cel IgM-antilichamen herkennen oxidatiespecifieke epitopen (OSE) die aanwezig zijn op pathogenen, apoptotische cellen en geoxideerde LDL, en IgM-binding aan OSE kunnen ontstekings downstream signalering voorkomen bij ziekten zoals atherosclerose11. Daarom kunnen strategieën om de IgM-productie te verhogen via het verhogen van peritoneale B-1a-celmigratie naar sites zoals het beenmerg therapeutisch nuttig zijn. Het is echter belangrijk dat dergelijke strategieën worden gericht en cel-type specifiek, als off-target effecten kunnen een negatieve invloed hebben op de immuunfunctie of gezondheid.

Hier beschrijven we een methode voor gerichte en langdurige overexpressie van CXCR4 in primaire murine B-1a cellen en de daaropvolgende adoptieoverdracht om celmigratie en functionele IgM-antilichaamproductie te visualiseren(figuur 1). Genetische manipulatie van primaire B-cellen wordt beperkt door lage transfectie-efficiëntie in vergelijking met transfectie van getransformeerde cellijnen. Aangezien getransformeerde cellijnen echter aanzienlijk kunnen afwijken van primaire cellen12,13,biedt het gebruik van primaire cellen waarschijnlijk resultaten die beter aansluiten op de normale fysiologie. Er zijn verschillende technieken beschreven voor genoverdracht in primaire murine B-cellen, waaronder retrovirale transductie, adenovirale transductie, lipofection of transporatiegebaseerde transfectie, die verschillende niveaus van efficiëntie, vergankelijkheid en impact hebben op de gezondheid van cellen13,14,15. De volgende methode gebruikt retrovirale transductie als het leverde voldoende genoverdracht efficiëntie van >30% terwijl een minimale invloed op de levensvatbaarheid van cellen. Het CXCR4-uitdrukkende retrovirus werd gegenereerd met behulp van de eerder beschreven retrovirale constructie murine stamcelvirus-interne ribosomale entry site-groene fluorescente eiwit (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, waarin de muis CXCR4 gen was sub-gekloond4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) en CXCR4-GFP retrovirale deeltjes werden gegenereerd met behulp van calciumfosfaattransfectie zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen4,14.

Succesvol getransduceerde B-1a cellen werden vervolgens intraveneus overgebracht naar lymfocyten-deficiënte Rag1-/- muizen. Zowel donor- als ontvangermuizen bevatten bovendien knock-out van het apolipoprotein E (ApoE)-gen, wat resulteert in een verhoogde OSE-accumulatie en atherosclerose, waardoor een model wordt voor in vivo B-1 celactivering en IgM-productie. Bovendien verschilden donor- en ontvangermuizen in CD45-allotype; donor B-1 cellen kwamen van CD45.1+ ApoE-/- muizen en werden overgebracht naar Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- ontvangers. Dit toegestaan differentiatie van donor CD45.1 van ontvanger CD45.2 B cellen post-overdracht zonder de noodzaak om bovendien vlek voor B-cel markers tijdens flow cytometrie analyse. De hier verstrekte resultaten tonen aan dat gerichte CXCR4 overexpressie op B-1a cellen associeert met een verhoogd vermogen van B-1a cellen om te migreren naar het beenmerg, die associeert met verhoogde plasma anti-OSE IgM. Daarnaast bieden we een methode voor de verrijking van buikvlies B-1 cellen door negatieve selectie en tonen we de eis van B-1 celactivering voor efficiënte transductie. Deze methode kan worden aangepast voor andere retrovirale constructies om het effect van eiwitoverexpressie op B-1a-celmigratie, fenotype of functie te bestuderen. Bovendien zou het gebruik van CD45.1 versus CD45.2 allotype onderscheid theoretisch overdracht naar andere immuun-voldoende murinemodellen met endogene B-cellen mogelijk kunnen maken.

Protocol

Alle dierenprotocollen zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia. 1. Magnetische scheiding en verrijking van buikvlies B-1 cellen Euthanaseren een 12−14 weken oude, man, CD45.1+ApoE-/- muis met CO2. Maak een oppervlakkige snede in de buik met behulp van rechte chirurgische schaar en schil terug huid met behulp van gebogen schaar om de buikvlieswand bloot. Spoel de buikholte met 10 mL van 37 °…

Representative Results

Een overzicht van het protocol is te vinden in figuur 1. Figuur 2 toont verrijking van buikvlies B-1a cellen na magnetische uitputting van andere peritoneale celtypen. Levende singlet cellen in de post-uitputting fractie hebben een groter percentage van CD19 + B cellen in vergelijking met F4/80+ macrofagen, gebrek aan CD5hi CD19- T cellen, en bevatten een verhoogde frequentie van CD19+ CD5mid B-1a cellen in …

Discussion

De hier geboden methode maakt stabiele en relatief efficiënte primaire B-1a-celgenlevering, in vivo adoptieoverdracht en identificatie en lokalisatie van geïnjecteerde cellen mogelijk. Cellen konden worden gedetecteerd 17 weken na de cel overdracht en behouden verhoogde CXCR4 expressie. Retrovirus-gemedieerde levering leverde 30-40% transductie-efficiëntie van primaire murine B-1a cellen met minimale impact op de levensvatbaarheid van de cel in onze handen(figuur 4e). Dit is in lijn met d…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 van P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) en R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye werd ondersteund door American Heart Association Pre-doctorale fellowship 16PRE30300002 en 5T32AI007496-20. Wij danken Joanne Lannigan, Mike Solga, en Claude Chew van de Universiteit van Virginia Flow Cytometrie Core voor hun uitstekende technische bijstand.

Materials

70 micron filter caps Falcon 352235
anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block Life Technologies MFCR00
B220 APC eBioscience 17-0452-83 Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
CD19 APCef780 eBioscience 47-0193-82 Clone: eBio1D3
CD23 biotin eBioscience 13-0232-81 Clone: B3B4
CD23 PECy7 eBioscience 25-0232-82 Clone: B3B4
CD3e biotin eBioscience 13-0033-85 Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560580 Clone: A20
CD45.2 BV421 BD Biosciences 562895 Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD5 PE eBioscience 12-0051-83 Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC eBioscience 17-9991-82 Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin Life Technologies MF48015 Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6 Treestar Inc. License required
Gentamicin Gibco 15710-064
Gr-1 biotin eBioscience 13-5931-82 Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum Gibco 16000-044
HEPES Gibco 15630-080
IgM PECF594 BD Biosciences 562565 Clone: R6-60.2
Insulin syringes BD Biosciences 329461
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405
Live/Dead Yellow Life Technologies L34968
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NK1.1 biotin BD Biosciences 553163 Clone: PK136
Non-essential amino acids Gibco 11140-050
ODN 1668 InvivoGen tlrl-1668
PBS Gibco 14190-144
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Ter119 biotin eBioscience 13-5921-82 Clone: Ter119

Riferimenti

  1. Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
  2. Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
  3. Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
  4. Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
  6. Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
  7. Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
  8. Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
  9. Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
  10. Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
  11. Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
  14. Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
  15. Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
  16. DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
  17. Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
  18. Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
  19. Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
  20. Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
  21. Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
  22. Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Upadhye, A., Marshall, M., Garmey, J. C., Bender, T. P., McNamara, C. Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production. J. Vis. Exp. (159), e61003, doi:10.3791/61003 (2020).

View Video