マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

最近の研究では、かなりの免疫細胞、特にB細胞、細胞の^,局在^{1、2、3、4、52,3}に依存¹するフェノティピックおよび機能的異質性が実証されている。^4,5B-1a細胞は、保護IgM抗体を産生する異種能力を有するそのような集団の1つである。骨髄B-1a細胞は、IgMを構成的に分泌し、血漿IgM力価⁶に大きく寄与する一方、腹膜B-1a細胞は恒常性で低レベルのIgM分泌を有し、代わりに自然なToll-like受容体(TLR)またはサイトカイン媒介シグナル伝達を介して活性化^{7,8,9,することができる。}B-1a細胞IgM抗体は、病原体、アポトーシス細胞、および酸化LDLに存在する酸化特異的エピトープ(OSE)を認識し、OSEにIgM結合すると、アテローム性動脈^{硬化症などの}疾患における炎症性下流シグナル伝達を防ぐことができる。したがって、骨髄のような部位への腹膜B-1a細胞遊泳を介してIgM産生を増加させる戦略は治療的に有用であり得る。しかし、オフターゲット効果が免疫機能や健康に悪影響を及ぼす可能性があるため、このような戦略を標的とし、細胞型特異的であることが重要です。

ここでは、一次マウスB-1a細胞におけるCXCR4の標的化および長期過剰発現の方法と、その後の細胞移動および機能IgM抗体産生を可視化するためのその後の導入導入について説明する(図1)。原発性B細胞の遺伝子操作は、トランスフェクション細胞株のトランスフェクションに比べてトランスフェクション効率が低い場合に制限されます。しかし、形質転換細胞株が^12,13の原細胞から著しく逸脱する可能性があるため^、13初等細胞の使用は、通常の生理学により密接に一致する結果をもたらす可能性が高い。レトロウイルス伝達、アデノウイルス伝達、リポフェクション、またはエレクトロポレーションベースのトランスフェクションを含む、一次マウスB細胞における遺伝子導入に関するいくつかの技術が記載^{,14,されているが、}これは、効率、一過性、および^{細胞の健康}への影響のレベルが異なる。以下の方法は、細胞生存率に影響を及ぼしながら>30%の十分な遺伝子導入効率を生み出すため、レトロウイルス伝達を利用した。CXCR4発現レトロウイルスは、前述のレトロウイルス構築マウス幹細胞ウイルス-内部リボソームエントリー部位-緑色蛍光タンパク質(MSCV-IRES-GFP;MigR1)^16,マウスCXCR4遺伝子がクローン⁴をサブクローニングした.MigR1 (制御(Ctl)-GFP) およびCXCR4-GFPレトロウイルス粒子は、前に公開されたプロトコル^4,,14に記載されているようにリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して生成した。

正常にB-1a細胞を導入し、次いで静脈内にリンパ球欠損^Rag1-/-マウスに移した。ドナーマウスとレシピエントマウスの両方に、さらにアポリポプロテインE(ApoE)遺伝子のノックアウトが含まれ、OSE蓄積およびアテローム性動脈硬化が増加し、それによってインビボB-1細胞活性化およびIgM産生のモデルを提供する。さらに、ドナーマウスとレシピエントマウスはCD45同種で異なった。ドナーB-1細胞はCD45.1+ApoE-/-マウスから来て、Rag1^-/- CD45.2+ ApoE-/-レシピエントに移された。^{-/- -/-}これにより、フローサイトメトリー分析中にB細胞マーカーの染色を追加する必要なしに、レシピエントCD45.2B細胞からのドナーCD45.1の転写後の分化が可能となった。ここで示した結果は、B-1a細胞上の標的CXCR4過剰発現が、B-1a細胞が骨髄に移行する能力の増加と関連していることを示し、これは血漿抗OSE IgMの増加と関連している。さらに、負選択による腹膜B-1細胞の濃縮方法を提供し、効率的なトランスダクションのためのB-1細胞活性化の要件を実証する。この方法は、B-1a細胞遊マイグレーション、表現型、または機能に対するタンパク質過剰発現の影響を研究するために、他のレトロウイルス構築物に適応することができる。さらに、CD45.1対CD45.2の同種区別の使用は、理論的には内因性B細胞を含む他の免疫不足のマウスモデルへの伝達を可能にする可能性がある。