Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Rasterelektronenmikroskop (SEM) Ultrastrukturanalyse und intrazelluläre Bildgebung ergänzen die Lichtmikroskopie zur dreidimensionalen Profilierung von Prokaryoten, Pflanzen und Tieren. Die hohe räumliche Auflösung eines SEM macht es zu einer der vielseitigsten und leistungsstärksten Techniken, die für die Untersuchung mikrostruktureller Eigenschaften von Proben im Nanometer-Mikrometer-Skala zur Verfügung stehen. Ausgetrocknete Exemplare werden zu kompositorischen und topographischen Strukturen mit intensiven Details aufgelöst, was die Grundlage für die Entwicklung gültiger Schlussfolgerungen über funktionelle Beziehungen^1,2,3 bildet. ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.}Bei der Interpretation von SEM-Bildern biologischer Proben ist es eine große Herausforderung, zwischen einheimischen Strukturen und den Artefakten zu unterscheiden, die während der Verarbeitung entstehen. SEM wird in der Regel mit sehr hohen Vakuums betrieben, um Interferenzen durch Gasmoleküle zu vermeiden, die die primären, sekundären oder zurückgestreuten Elektronenstrahlen der Probe^10,11beeinflussen. Außerdem sind biologische Materialien aufgrund ihrer schlechten oder nicht leitenden Eigenschaften anfällig für Strahlungsschäden. Es ist wichtig, dass die in das SEM geladenen Proben vollständig trocken und frei von organischen Verunreinigungen sind, um mögliche Ausgasungen in einer Hochvakuumumgebung zu vermeiden^10,11. Da biologische Proben meist aus Wasser bestehen, sind zusätzliche Präparative Techniken erforderlich, um sicherzustellen, dass die einheimischen Strukturen erhalten bleiben.

Die erhaltene Auflösung basiert auf der Optimierung von Vorbereitungsmethoden, die für Probentypen und verwendete Instrumentparameter spezifisch sind. Daher ist es notwendig, die Verwendung von generalisierten Verarbeitungsschritten für alle Gewebetypen zu vermeiden. Einige biologische Proben benötigen eine weniger strenge Verarbeitung, um ihre Struktur zu erhalten, während für empfindliche Probentypen möglicherweise mehr Zeit und Sorgfalt erforderlich sind, um das Einbringen von Trocknungsartefakten wie Schrumpfung und Kollaps zu vermeiden. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in der SEM-Bildgebung; die Ergebnisse morphometrischer Studien werden durch Probenvorbereitungsverfahren^12,13bemerkenswert beeinflusst. Häufige Vorbereitungsschritte für viele biologische Proben sind Fixierung, Dehydrierung und Beschichtung mit einem Metall wie Gold, Platin oder Palladium, um ihre Oberflächen leitfähig für die SEM-Analyse umzuwandeln. Die Art und Kombination der verwendeten Schritte hängt von der Art des Gewebes und den spezifischen Zielen der Studie ab. Ladungsaufbau, Empfindlichkeit gegenüber Vakuum- und Elektronenstrahlschäden stellen Probleme bei der Verarbeitung weicher empfindlicher biologischer Proben dar, was zusätzliche Verarbeitungsschritte erforderlich macht, um die native Struktur des Objekts beizubehalten. Mit konventionellen Methoden wie Osmiumtetroxid-Fixierung, und Dehydrierung verursachen Schrumpfung und den Zusammenbruch von empfindlichen Geweben^14,15,16,17. Ziel der Studie ist es, elegante Methoden zu etablieren, die durch die Kombination von Ideen aus früheren Studien mit Modifikationen zur Herstellung und Abbildung von weichen empfindlichen Geweben (z. B. Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen) abgeleitet werden.

Die Auswahl eines geeigneten Befestigungsverfahrens ist der erste wichtigste Schritt für die mikroskopische Analyse biologischer Proben. Die Fixierung des Gewebes unmittelbar nach der Isolierung von einem Organismus ist wichtig, um Veränderungen in ihrer Morphologie durch Zersetzung zu verhindern. Ein wirksames Fixierungsmittel sollte zelluläre Prozesse beenden, indem es die Zellen schnell durchdringt und die Wirkung irreversibel beibehält, um die Struktur der Probe zu stabilisieren, um sowohl nachfolgenden Verarbeitungsschritten als auch einer Untersuchung unter dem SEM¹⁷ standzuhalten. ^{, 18}. Obwohl mehrere chemische und physikalische Fixierungsmethoden bekannt sind, wird chemische Fixierung häufiger für biologische Proben verwendet, um zelluläre Veränderungen aufgrund von Autolyse-, Verwesungs- und Trocknungseffekten zu vermeiden. Es gibt zahlreiche fixative chemische Formulierungen in der Literatur diskutiert^{17,19,20,21,22,23}, Fixative, die durch Denaturierung und koagierende biologische Makromoleküle und solche, die durch kovalent vernetzung von Makromolekülen fixieren. Alkohole werden als denaturierende Fixative verwendet, die die Ultrastruktur sehr schlecht erhalten und hauptsächlich für die Lichtmikroskopie verwendet werden und nicht für elektronenmikroskopische Analysen empfohlen werden. Vernetzung von Fixativen wie Formaldehyd, Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid erzeugen eine intermolekulare und intramolekulare Vernetzung zwischen Makromolekülen innerhalb des Gewebes und bieten eine hervorragende Konservierung von Ultrastrukturen^{11 ,24,25,26}. Biologische Proben sind temperaturempfindlich. Die Temperatur zu Beginn der Fixierung wird empfohlen, 4 °C zu sein, um die laterale Mobilität von Membranproteinen zu reduzieren, die Diffusion interzellulärer Moleküle zu verlangsamen und die Fixierungsrate zu verlangsamen¹¹. Die für die Behebung des Gewebes benötigte Zeit hängt weitgehend von der Größe der Probe und der Geschwindigkeit ab, mit der das Fixierungsmittel mit den Komponenten der Probe diffundiert und reagiert. Eine nächtliche Fixierung in 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd in PBS bei 4 °C ist die bevorzugte Methode für die SEM-Analyse von Proben, die in dieser Studie für ihre sequenziellen penetrativen Eigenschaften verwendet werden, die die Verarbeitung kleinerer empfindlicher Proben ermöglichen^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. Ein Post-Fixierungsschritt mit Osmiumtetroxid wird nicht nur aufgrund seiner toxischen Natur eliminiert, sondern auch festgestellt, dass er keinen zusätzlichen Vorteil zur Verbesserung der Bildqualität für die in dieser Studie analysierten Proben implementiert.

Biologische Proben enthalten Flüssigkeiten, die den SEM-Betrieb stören; Daher müssen die Proben getrocknet werden, bevor sie in die SEM-Probenkammer eingesetzt werden. Sobald die Austrocknung gewährleistet ist, muss das Lösungsmittel aus dem Gewebe entfernt werden, ohne aufgrund der Oberflächenspannung/-trocknung Artefakte in die Proben zu erzeugen. Drei verschiedene Trocknungsmethoden wurden häufig bei der Verarbeitung von Geweben für die SEM-Bildgebung verwendet: Lufttrocknung, kritische Punkttrocknung und Gefriertrocknungsproben^28,29,30,31. Wenige Studien berichten von allen drei Trocknungsmethoden, die identische Ergebnisse mit tierischen Gewebeproben^28,29,30,31ergeben. Eine allgemeine Praxis, die für kleinere Proben verwendet wird, ist die chemische Dehydrierung durch aufsteigende Konzentrationsreihen von Alkohol und Hexamethyldisilazan (HMDS), aber größere Proben werden mit einem kritischen Punkttrocknungsgerät (CPD)³²getrocknet. Während des Trocknungsprozesses bilden sich erhebliche Kräfte in kleinen Hohlräumen, die durch eine Flüssigkeits-/Gasschnittstelle durch die Probe geleitet werden; dies kann sogar zu einem vollständigen Zusammenbruch der Hohlkonstruktionen^{führen 33}. Jede Verformung, die durch die Behandlung auftritt, könnte dann als natives strukturelles Merkmal der Probe verwechselt werden. So sollte das generalisierte Phänomen für die Verarbeitung eliminiert und ein einzigartiger Trocknungsprozess für jeden Gewebetyp standardisiert werden, insbesondere wenn empfindliche Gewebeproben analysiert werden.

In mehreren Versuchen, die mit verschiedenen Kombinationen aller oben genannten Verfahren durchgeführt wurden, standardisierten wir die Methoden, die für die SEM-Analyse von drei empfindlichen Geweben verwendet werden können: Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen. Entwicklungsbiologen und Morphologen beschreiben normale und abnorme Morphogenese während der Embryoentwicklung bei repräsentativen Wirbeltieren. Untersuchungen zu Gensignalwegen hängen von der morphologischen Beschreibung neuartiger Strukturen ab. Um eine abrupte Veränderung der Wirbeltier-Embryostruktur während der SEM-Analyse zu vermeiden, empfehlen wir eine chemische Trocknung nach Austrocknung. Chemische Trocknung mit HMDS ist die relativ neueste Trocknungsmethode und die Vorteile sind relative Schnelligkeit, Benutzerfreundlichkeit, Kostenverluste und das begrenzte Know-how und die benötigte Ausrüstung⁹. CPD ist eine häufig verwendete Trocknungstechnik, bei der CO₂ bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten Druck über die Proben hinweg gesteuert wird. Wir haben festgestellt, dass HMDS zum Trocknen von weichen empfindlichen Geweben geeignet ist und die Verarbeitung größerer Proben im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung ermöglicht, die eine umfangreiche Verformung embryonaler Gewebe verursachte. Mehrere Methoden wurden verwendet, um Proben für SEM-Bildgebung vorzubereiten, um die morphologischen Eigenschaften von Pilzen zu untersuchen³⁴. Pilzproben werden häufig in Osmiumtetroxid, gefolgt von Ethanoldehydrierung und kritischer Punkttrocknung, fixiert, was zufriedenstellende Ergebnisse liefern kann, obwohl die toxischen Wirkungen von Osmiumtetroxid^6,7,35 und der Verlust von Pilzmaterialien beim Wechsel von Lösungen während der Verarbeitung sind ausgesprochene Nachteile. Die Probenvorbereitungstechnik mit Lufttrocknung ohne Fixierung wurde ebenfalls³⁶ praktiziert, führt aber zu geschrumpften und zusammengebrochenen Strukturen, und die Beobachtung solcher Proben kann leicht falsch interpretiert werden, während die Art charakterisiert wird. Pilz-Hypha verliert seine Integrität in Kontakt mit Flüssigkeiten und eine gleichmäßige Trocknung kann nicht erreicht werden, um die Struktur wiederherzustellen. Aufgrund dieses Effekts wird die Gefriertrocknung häufig zum Trocknen von Weichgeweben wie Pilzmyzel verwendet. Gefriertrocknung funktioniert gut für saubere Materialien, aber das Vorhandensein von Salzen oder Sekretion wird Oberflächendetails verdecken, die nur auf der SEM-Betrachtungsphase identifiziert werden. Wir haben die Gleitkulturmethode mit Glutaraldehyd-Fixierung und kritischer Punkttrocknung gekoppelt, um strukturelle Details intakter Pilzhyphen und Sporen zu ergeben. Obwohl die CPD-Trocknung schrumpfe in Embryonen, führte sie in Verbindung mit der Glutaraldehyd-Fixierung zu gut erhaltenen myzelialen Strukturen. Die Eierschale ist von primärer Bedeutung für den Embryo von eiförmigen Tieren, da sie nicht nur als Schutzhülle fungiert, sondern auch mechanische Stabilität, Durchlässigkeit für Gas und Wasser und eine Kalziumreserve für den sich entwickelnden Embryo bietet. Süßwasserschildkröten-Eierschalen werden aufgrund ihrer Struktur als “starr” eingestuft und aufgrund ihrer Verfügbarkeit von Biologen^mitgroßer Aufmerksamkeit 1^{,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

Wir beschreiben einfache Methoden zur einfachen Untersuchung von Eierschalen- und Schalenmembranen von lackierten Schildkröten, die auf jede starre Eierschalenart angewendet werden können. Die Methoden der Vorbereitung wurden anhand der resultierenden Bildqualität und reduzierten potenziellen Artefakten bewertet.