Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

Scanning elektronen microscoop (SEM) ultrastructurele analyse en intracellulaire Imaging supplement Lichtmicroscopie voor driedimensionale profilering van prokaryoten, planten en dieren. De hoge ruimtelijke resolutie van een SEM maakt het een van de meest veelzijdige en krachtige technieken die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van microstructurele kenmerken van specimens op de nanometer tot micrometer schaal. Gedroogde specimens worden herleid tot samenstellings-en topografische structuren met intense Details, die de basis vormen voor het ontwikkelen van geldige conclusies over functionele relaties^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. bij het INTERPRETEREN van SEM-afbeeldingen van biologische specimens, is het een grote uitdaging om onderscheid te maken tussen inheemse structuren en de artefacten die tijdens de verwerking worden gemaakt. SEM wordt over het algemeen gebruikt bij zeer hoge stofzuigers om interferentie te voorkomen van gasmoleculen die de primaire, secundaire of backverstrooide elektronenstralen van het monster^10,11aantasten. Ook zijn biologische materialen vatbaar voor stralings schade door hun slechte of niet-geleidende eigenschappen. Het is van essentieel belang dat de in het SEM geladen specimens volledig droog zijn en vrij zijn van organische verontreinigingen om eventuele Uitgassen in een hoge vacuüm omgeving van^10,11te elimineren. Aangezien biologische specimens meestal uit water bestaan, zijn er aanvullende preparatieve technieken nodig om ervoor te zorgen dat de inheemse structuren behouden blijven.

De verkregen resolutie is gebaseerd op het optimaliseren van bereidingsmethoden specifiek voor specimen types en instrumentale parameters gebruikt. Dus, is het noodzakelijk om te voorkomen dat het gebruik van gegeneraliseerde verwerkingsstappen voor alle weefsel typen. Sommige biologische specimens vereisen minder strenge verwerking om hun structuur te behouden, terwijl er meer tijd en zorg nodig kan zijn voor delicate soorten monsters om de invoering van droog artefacten, zoals krimp en ineenstorting, te voorkomen. Monstervoorbereiding is een cruciale stap in SEM-beeldvorming; de bevindingen van Morfometrische studies zijn opmerkelijk beïnvloed door preparaat bereidings procedures^12,13. Veelgebruikte voorbereidingsstappen voor veel biologische monsters zijn fixatie, uitdroging en coating met een metaal zoals goud, platina of Palladium om hun oppervlakken te converteren naar geleidende voor SEM-analyse. De aard en combinatie van de gebruikte stappen zal variëren afhankelijk van het type van het weefsel, en de specifieke doelstellingen van de studie. De opbouw van de lading, gevoeligheid voor vacuüm-en elektronenstraal schade vormen problemen bij het verwerken van zachte delicate biologische monsters, wat extra verwerkingsstappen vereist om de inheemse structuur van het object te behouden. Met behulp van conventionele methoden zoals osmium tetroxide Fixing, en uitdroging veroorzaken krimp en de ineenstorting van delicate weefsels^14,15,16,17. Het doel van de studie is het opzetten van elegante methodologieën die zijn afgeleid door het combineren van ideeën uit eerdere studies met aanpassingen om zachte delicate weefsels voor te bereiden en te maken (bijv. reptielen embryo’s, eierschalen van geschilderde schildpadden en schimmel culturen).

Selectie van een geschikte bevestigingsmethode is de eerste belangrijkste stap voor microscopische analyse van biologische specimens. Het is essentieel om de weefsels onmiddellijk na het isoleren van een organisme te fixeren om veranderingen in hun morfologie als gevolg van ontleding te voorkomen. Een effectieve fixatie moet cellulaire processen beëindigen door de cellen snel te doordringen en het effect onomkeerbaar te houden om de structuur van het monster te stabiliseren om zowel de volgende verwerkingsstappen te weerstaan als het onderzoek onder de SEM^{17 , 18}. Hoewel verschillende chemische en fysische fixatie methoden bekend zijn, wordt chemische fixatie vaker gebruikt voor biologische specimens om cellulaire veranderingen als gevolg van autolyse, putrefactie en droog effecten te voorkomen. Er zijn talrijke fixatieve chemische formuleringen besproken in de literatuur^{17,19,20,21,22,23}, fixeermiddelen die werken door denaturering en stolling van biologische macromoleculen, en die die repareren door covalent cross-linking macromoleculen. Alcoholen worden gebruikt als denaturerende fixeermiddelen die ultra structuur zeer slecht behouden en worden meestal gebruikt voor lichte microscopie en niet aanbevolen voor elektronen microscopische analyse. Kruislings verbindende Fixatieven zoals formaldehyde, glutaraldehyde en osmium tetroxide creëren intermoleculaire en intramoleculaire crosslinking tussen macromoleculen binnen de weefsels, wat een uitstekend behoud van ultra-structuren oplevert^{11 ,24,25,26}. Biologische monsters zijn gevoelig voor temperatuur. De temperatuur aan het begin van de fixatie wordt aanbevolen om 4 °C te zijn om de laterale mobiliteit van membraan proteïnen te verminderen, om de diffusie van intercellulaire moleculen te vertragen en om de snelheid van fixatie te vertragen¹¹. De tijd die nodig is voor de vaststelling van weefsels hangt grotendeels af van de grootte van het monster en de snelheid waarmee de fixatie diffitert en reageert met de componenten van het preparaat. Een overnachting fixatie in 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde in PBS bij 4 °C is de voorkeursmethode voor SEM-analyse van specimens die in deze studie worden gebruikt voor hun sequentiële penetratieve eigenschappen, waardoor kleinere delicate monsters kunnen worden verwerkt^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. een post-fixatie stap met osmium tetroxide wordt niet alleen geëlimineerd vanwege zijn toxische aard, maar heeft ook tot gevolg dat er geen bijkomend voordeel wordt toegepast om de beeldkwaliteit te verbeteren voor de monsters die in deze studie worden geanalyseerd.

Biologische monsters bevatten vloeistoffen die interfereren met de SEM-werking; Vandaar dat de monsters moeten worden gedroogd voordat ze in de SEM-monsterkamer worden ingevoegd. Zodra uitdroging is verzekerd, moet het oplosmiddel uit het weefsel worden verwijderd zonder artefacten in de specimens te maken vanwege de oppervlaktespanning/droging. Drie verschillende droog methoden werden vaak gebruikt tijdens het verwerken van weefsels voor SEM-beeldvorming: luchtdroging, het drogen van kritische punten en vriesdrogen monsters^28,29,30,31. Weinig studies rapporteren alle drie droog methoden die identieke resultaten produceren met dierlijk weefselmonsters^28,29,30,31. Een algemene praktijk die voor kleinere specimens wordt gebruikt, zijn chemische uitdroging door oplopende concentratie Series alcohol en Hexamethyldisilazaan (HMD’S), maar grotere specimens worden gedroogd met behulp van een kritisch punt drogen (CPD) instrument³². Tijdens het droogproces worden aanzienlijke krachten gevormd in kleine holten die door een vloeistof/gasinterface door het preparaat worden doorgegeven; Dit kan zelfs leiden tot een volledige ineenstorting van de holle structuren³³. Elke vervorming die optreedt als gevolg van de behandeling kan dan worden verward als een native structureel kenmerk van het preparaat. Zo moet het gegeneraliseerde fenomeen voor de verwerking worden geëlimineerd en moet een uniek droogproces worden gestandaardiseerd voor elk type weefsel, vooral wanneer delicate weefselmonsters worden geanalyseerd.

In verschillende proeven uitgevoerd met behulp van verschillende combinaties van alle bovengenoemde processen, we gestandaardiseerd de methoden die kunnen worden gebruikt voor SEM analyse van drie delicate weefsels: reptielen embryo’s, eierschalen van geschilderde schildpadden, en schimmel culturen. Ontwikkelingsbiologen en morfologen beschrijven normale en abnormale morfogenese tijdens de ontwikkeling van embryo’s bij representatieve gewervelde dieren. Onderzoeken naar gensignalerings trajecten hangen af van de morfologische beschrijving van nieuwe structuren. Om een abrupte verandering in de gewervelde embryo structuur te voorkomen tijdens SEM-analyse, raden we aan chemisch drogen na uitdroging. Chemisch drogen met HMDS is de relatief nieuwste droogmethode en de voordelen zijn relatieve snelheid, gebruiksgemak, verloren kosten en de beperkte expertise en uitrusting die nodig is⁹. CPD is een veelgebruikte droogtechniek met behulp van afdraaien co₂ over de specimens bij een specifieke temperatuur en druk. We identificeerden dat HMDS geschikt is voor het drogen van zachte delicate weefsels en maakt het mogelijk grotere monsters te verwerken in vergelijking met kritische punt droging, wat een uitgebreide vervorming van embryonale weefsels veroorzaakte. Er zijn verschillende methoden gebruikt om monsters voor SEM-beeldvorming voor te bereiden om de morfologische kenmerken van schimmels³⁴te bestuderen. Schimmel preparaten worden vaak vastgesteld in osmium tetroxide, gevolgd door ethanol uitdroging en kritische punt droging, wat bevredigende resultaten kan opleveren, hoewel de toxische effecten van osmium tetroxide^6,7,35 en het verliezen van schimmel materialen terwijl het veranderen van oplossingen tijdens de verwerking zijn uitgesproken nadelen. De monster bereidingstechniek met behulp van lucht drogen zonder fixatie is ook beoefend³⁶ maar resulteert in gekrompen en ingeklapte structuren, en observatie van dergelijke specimens kan gemakkelijk worden geïnterpreteerd terwijl het karakteriseren van de soort. Schimmel hypha verliest zijn integriteit in contact met vloeistoffen en een gelijkmatige droging kan niet worden bereikt om de structuur te herstellen. Als gevolg van dit effect, vriesdrogen wordt vaak gebruikt voor het drogen van zachte weefsels zoals schimmel mycelium. Vriesdrogen werkt goed voor schone materialen, maar de aanwezigheid van zouten of secretie zal het oppervlak detail dat alleen in de SEM-kijk fase zal worden geïdentificeerd, verhullen. We koppelden de Slide Culture Method met Glutaaraldehyde bevestiging en kritische punt droging om structurele details van intacte schimmel schimmeldraden en sporen te geven. Hoewel het drogen van CPD veroorzaakt krimp in embryo’s, resulteerde het in goed bewaard gebleven myceliële structuren in combinatie met Glutaaraldehyde fixatie. De eierschaal is van primair belang voor het embryo van ovipareuze dieren door niet alleen als beschermende bekleding te fungeren, maar ook mechanische stabiliteit, permeabiliteit aan gas en water, en een calcium reserve voor het zich ontwikkelende embryo te bieden. Zoet waterschildpad eierschalen worden geclassificeerd als “rigide” op basis van hun structuur, en vanwege hun beschikbaarheid hebben aanzienlijke aandacht gekregen van biologen^{1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

We detail eenvoudige methoden voor eenvoudig onderzoek van de eierschaal en shell membranen van geschilderde schildpad die kan worden toegepast op elke stijve eierschaal soorten. Voorbereidings methoden werden geëvalueerd op basis van de resulterende beeldkwaliteit en verminderde potentiële artefacten.