Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Análise ultraestrutural do microscópio eletrônico de varredura (SEM) e microscopia de luz intracelular do suplemento da imagem latente para o perfilamento tridimensional dos prokaryotes, das plantas, e dos animais. A alta resolução espacial de um MEV torna uma das técnicas mais versáteis e poderosas disponíveis para o exame de características microestruturais de espécimes no nanômetro para escala de micrômetro. Espécimes dessecados são resolvidos para estruturas composicional e topográficas com detalhes intensos, o que fornece a base para o desenvolvimento de conclusões válidas sobre as relações funcionais^{1,2,3 , 4. º , 5. º , 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9}. ao interpretar imagens de sem de espécimes biológicos, é um grande desafio distinguir entre estruturas nativas e os artefatos que são criados durante o processamento. O SEM é operado geralmente em aspiradores muito elevados para evitar toda a interferência das moléculas de gás que afetam os feixes de elétron preliminares, secundários ou backdispersos emitidos da amostra^10,11. Também, os materiais biológicos são suscetíveis aos danos da radiação devido a suas propriedades pobres ou não-conduzindo. É essencial para que os espécimes carregados no sem sejam completamente secos e livres de todos os contaminadores orgânicos para eliminar todo o desgaseificação possível em um ambiente elevado do vácuo^10,11. Como espécimes biológicos são principalmente compostos de água, técnicas preparativas adicionais são necessárias para garantir que as estruturas nativas são mantidas.

A resolução obtida é baseada na otimização dos métodos de preparo específicos para os tipos de amostras e parâmetros instrumentais utilizados. Assim, é necessário evitar o uso de etapas de processamento generalizado para todos os tipos de tecido. Alguns espécimes biológicos exigirá um processamento menos rigoroso para preservar sua estrutura, enquanto mais tempo e cuidados podem ser necessários para tipos delicados de amostras para evitar a introdução de artefatos de secagem, como encolhimento e colapso. A preparação da amostra é um passo crítico na imagem SEM; os achados dos estudos morfométricos são notavelmente influenciados pelos procedimentos de preparo do espécime^12,13. As etapas comuns da preparação para muitas amostras biológicas são fixação, desidratação e revestimento com um metal tal como o ouro, a platina ou o paládio para converter suas superfícies para ser condutoras para a análise de SEM. A natureza e a combinação das etapas utilizadas variarão dependendo do tipo de tecido e dos objetivos específicos do estudo. Acúmulo de carga, sensibilidade ao vácuo e dano de feixe de elétrons colocam problemas ao processar amostras biológicas delicadas suaves, necessitando de etapas adicionais de processamento para reter a estrutura nativa do objeto. O uso de métodos convencionais como a fixação do tetróxido de ósmio e a desidratação causam encolhimento e o colapso dos tecidos delicados^14,15,16,17. O objetivo do estudo é estabelecer metodologias elegantes derivadas combinando ideias de estudos anteriores com modificações para preparar e imagem de tecidos delicados macios (por exemplo, embriões de répteis, casca de ovo de tartarugas pintadas e culturas fúngicas).

A seleção de um método apropriado da fixação é a primeira etapa a mais importante para a análise microscópica de espécimes biológicos. A fixação dos tecidos imediatamente após o isolamento de um organismo é essencial para evitar alterações na sua morfologia devido à decomposição. Um fixador eficaz deve encerrar os processos celulares, permeando as células rapidamente e mantendo o efeito irreversivelmente para estabilizar a estrutura da amostra para suportar as etapas de processamento subsequentes e exame o SEM^{17 , 18}. embora diversos métodos químicos e físicos da fixação sejam sabidos, a fixação química é usada mais geralmente para espécimes biológicos para evitar todas as mudanças celulares devido à autólise, ao putrefaction, e aos efeitos de secagem. Existem inúmeras formulações químicas fixativas discutidas na literatura^{17,19,20,21,22,23}, fixativas que trabalham por desnaturação e coagulando macromoléculas biológicas, e aquelas que fixam por macromoléculas de ligação cruzada covalentemente. Os álcoois são usados como fixadores desnaturando que preservam ultraestrutura muito mal e são usados na maior parte para a microscopia de luz e não recomendado para a análise microscópica do elétron. Os fixadores cross-linking como o formaldeído, o glutaraldeído e o tetróxido do ósmio criam o reticulação intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro dos tecidos, fornecendo a preservação excelente das ultra-estruturas^{11 ,24,25,26}. As amostras biológicas são sensíveis à temperatura. Recomenda-se que a temperatura no início da fixação seja de 4 ° c para reduzir a mobilidade lateral das proteínas da membrana, para retardar a difusão das moléculas intercelulares e retardar a taxa de fixação¹¹. O tempo necessário para a fixação dos tecidos depende em grande parte do tamanho da amostra e da velocidade com que o fixador se difunde e reage com os componentes da amostra. Uma fixação durante a noite em paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% em PBS a 4 ° c é o método preferencial para a análise de MeV de espécimes utilizados neste estudo para suas propriedades penetrantes sequenciais, que permitem a transformação de amostras delicadas menores^{17 , 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20} anos de ^{, 27}. um passo pós-fixação com tetroxida de ósmio é eliminado não só devido à sua natureza tóxica, mas também não foi encontrado para implementar nenhuma vantagem adicional para melhorar a qualidade da imagem para as amostras analisadas neste estudo.

As amostras biológicas contêm fluidos que interferem na operação de SEM; daqui, as amostras precisam de ser secas antes de inseri-la na câmara da amostra de SEM. Uma vez que a desidratação é assegurada, o solvente deve ser removido do tecido sem criar artefatos nos espécimes devido à tensão de superfície/secagem. Três diferentes métodos de secagem foram comumente utilizados durante o processamento de tecidos para sem imagem: secagem de ar, secagem de ponto crítico e congelamento de amostras de secagem^28,29,30,31. Poucos estudos relatam todos os três métodos de secagem produzindo resultados idênticos com amostras de tecido animal^28,29,30,31. Uma prática geral usada para espécimes menores são a desidratação química por série de concentração ascendente de álcool e hexametildissilazano (HMDS), mas os espécimes maiores são secos usando um ponto crítico de secagem (CPD) instrumento³². Durante o processo de secagem, forças consideráveis formadas em pequenas cavidades que são passadas através do espécime por uma interface de líquido/gás; Isto pode mesmo conduzir a um colapso completo das estruturas ocas³³. Qualquer deformação que ocorra devido ao tratamento pode então ser confundida como uma característica estrutural nativa do espécime. Assim, o fenômeno generalizado para o processamento deve ser eliminado e um processo de secagem original deve ser estandardizado para cada tipo de tecido especial quando os espécimes delicados do tecido são analisados.

Em vários ensaios realizados utilizando várias combinações de todos os processos acima mencionados, padronizamos os métodos que podem ser utilizados para a análise de MeV de três tecidos delicados: embriões de répteis, cascas de ovos de tartarugas pintadas e culturas fúngicas. Biólogos e morfologistas do desenvolvimento descrevem morfogênese normal e anormal durante o desenvolvimento embrionário em animais vertebrados representativos. As investigações sobre as vias de sinalização genética dependem da descrição morfológica das novas estruturas. Para evitar qualquer mudança abrupta na estrutura do embrião de vertebrados durante a análise de SEM, recomendamos a secagem química após a desidratação. A secagem química usando HMDS é o método de secagem relativamente o mais novo e as vantagens incluem o quickness relativo, a facilidade de utilização, o custo perdido, e a perícia e o equipamento limitados necessários⁹. O CPD é uma técnica de secagem comumente usada usando o de co₂ nos espécimes em uma temperatura e pressão específicas. Nós identificamos que HMDS é apropriado para secar tecidos delicados macios e permite que as amostras maiores sejam processadas comparadas à secagem crítica do ponto, que causou a deformação extensiva aos tecidos embrionário. Vários métodos têm sido utilizados para preparar amostras para a imagem SEM para estudar as características morfológicas dos fungos³⁴. Os espécimes fúngicos são comumente fixados em tetroxida de ósmio, seguidos por desidratação de etanol e secagem de ponto crítico, o que pode proporcionar resultados satisfatórios, embora os efeitos tóxicos do ósmio tetroxida^6,7,35 e perder materiais fúngicos, enquanto as soluções em mudança durante o processamento são desvantagens pronunciadas. A técnica da preparação da amostra que usa o ar-secagem sem fixação foi praticada igualmente³⁶ mas resultados em estruturas encolhidos e desmoronadas, e a observação de tais espécimes pode facilmente ser interpretada mal ao caracterizar a espécie. A hipha fúngica perde sua integridade em contato com líquidos e uma secagem até mesmo pode não ser alcançada para restaurar a estrutura. Devido a este efeito, a liofilização é comumente usada para secar tecidos moles como micélio fúngico. A secagem por congelamento funciona bem para materiais limpos, mas a presença de quaisquer sais ou secreção obscurecer os detalhes superficiais que serão identificados apenas no estágio de visualização de SEM. Nós acoplamos o método da cultura da corrediça com fixação do glutaraldeído e ponto crítico que secam para render detalhes estruturais de hifas e de spores fungosos intactos. Embora a secagem do CPD causasse o encolhimento nos embriões, conduziu às estruturas micelial bem preservadas quando acoplada com a fixação do glutaraldeído. A casca de ovo é de importância primordial para o embrião de animais oviparosos, não só agindo como uma cobertura protetora, mas também proporcionando estabilidade mecânica, permeabilidade ao gás e água, e uma reserva de cálcio para o embrião em desenvolvimento. As cascas de água doce da tartaruga são classificadas como “rígidas” com base em sua estrutura, e devido à sua disponibilidade têm recebido atenção significativa dos biólogos^{1,2,3,4 , 5. º , 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 37 , 38}.

Nós detalham métodos simples para a examinação fácil da casca de ovo e das membranas da casca da tartaruga pintada que pode ser aplicada a toda a espécie rígida da casca de ovo. As metodologias de preparação foram avaliadas com base na qualidade da imagem resultante e redução de artefatos potenciais.