Traitement de l'embryon, de la coquille d'œuf et de la culture fongique pour la microscopie électronique à balayage

L’analyse ultrastructurale de microscope électronique de balayage (SEM) et la microscopie intracellulaire de formation image complètent la lumière pour le profilage tridimensionnel des procaryotes, des usines, et des animaux. La haute résolution spatiale d’un SEM en fait l’une des techniques les plus polyvalentes et les plus puissantes disponibles pour l’examen des caractéristiques microstructurales des spécimens à l’échelle nanométrique à micromètre. Les spécimens desséchés sont résolus aux structures compositionnelles et topographiques avec le détail intense, qui fournit la base pour développer des conclusions valides au sujet des relations fonctionnelles^{1,2,3 , 4 ( en} plus) ^{, 5 Annonces , 6} Annonces ^{, 7 Annonces , 8 Annonces , 9}. Lors de l’interprétation des images SEM de spécimens biologiques, il est très difficile de faire la distinction entre les structures indigènes et les artefacts qui sont créés au cours du traitement. SEM est généralement exploité à des vides très élevés pour éviter toute interférence des molécules de gaz affectant les faisceaux d’électrons primaires, secondaires ou rétrodiffusés émis par l’échantillon^10,11. En outre, les matériaux biologiques sont sensibles aux dommages causés par les radiations en raison de leurs propriétés pauvres ou non conductrices. Il est essentiel que les spécimens chargés dans le SEM soient complètement secs et exempts de tout contaminant organique afin d’éliminer tout dégazage possible dans un environnement à vide élevé^10,11. Comme les spécimens biologiques sont principalement composés d’eau, d’autres techniques de préparation sont nécessaires pour s’assurer que les structures indigènes sont conservées.

La résolution obtenue est basée sur l’optimisation des méthodes de préparation spécifiques aux types de spécimens et aux paramètres instrumentaux utilisés. Ainsi, il est nécessaire d’éviter d’utiliser des étapes de traitement généralisées pour tous les types de tissus. Certains spécimens biologiques exigeront un traitement moins rigoureux pour préserver leur structure, tandis que plus de temps et de soins pourraient être nécessaires pour les types délicats d’échantillons afin d’éviter l’introduction d’artefacts de séchage, tels que le rétrécissement et l’effondrement. La préparation de l’échantillon est une étape critique dans l’imagerie SEM; les résultats des études morphométriques sont remarquablement influencés par les procédures de préparation des spécimens^12,13. Les étapes de préparation courantes pour de nombreux échantillons biologiques sont la fixation, la déshydratation et le revêtement avec un métal comme l’or, le platine ou le palladium pour convertir leurs surfaces pour être conductrices pour l’analyse SEM. La nature et la combinaison des étapes utilisées varient selon le type de tissu et les objectifs spécifiques de l’étude. L’accumulation de charges, la sensibilité aux dommages causés par le vide et les faisceaux d’électrons posent des problèmes lors du traitement d’échantillons biologiques délicats, ce qui fait qu’il faut d’autres étapes de traitement pour conserver la structure indigène de l’objet. L’utilisation de méthodes conventionnelles telles que la fixation du tétroxide d’osmium, et la déshydratation causent le rétrécissement et l’effondrement des tissus délicats^14,15,16,17. L’objectif de l’étude est d’établir des méthodologies élégantes dérivées en combinant des idées d’études antérieures avec des modifications pour préparer et imager les tissus délicats mous (p. ex. embryons de reptiles, coquille d’œuf de tortues peintes et cultures fongiques).

La sélection d’une méthode de fixation appropriée est la première étape la plus importante pour l’analyse microscopique des spécimens biologiques. La fixation des tissus immédiatement après l’isoler d’un organisme est essentielle pour empêcher l’altération de leur morphologie due à la décomposition. Un fixatif efficace devrait mettre fin aux processus cellulaires en permédiant les cellules rapidement et en maintenant l’effet de façon irréversible pour stabiliser la structure de l’échantillon pour résister à la fois aux étapes de traitement et à l’examen ultérieurs dans le cadre du SEM^{17 , 18}. Bien que plusieurs méthodes chimiques et physiques de fixation soient connues, la fixation chimique est plus couramment utilisée pour les spécimens biologiques afin d’éviter tout changement cellulaire dû à l’autolyse, à la putréfaction et aux effets de séchage. Il existe de nombreuses formulations chimiques fixatives discutées dans la littérature^{17,19,20,21,22,23}, fixatives qui fonctionnent par dénaturation et coagulant les macromolécules biologiques, et celles qui se fixent par macromolécules covalentes de liaison croisée. Les alcools sont utilisés comme fixatifs dénaturants qui préservent l’ultrastructure très mal et sont utilisés principalement pour la microscopie légère et non recommandés pour l’analyse microscopique des électrons. Les fixatifs croisés comme le formaldéhyde, le glutaraldéhyde et le tétroxide d’osmium créent des liaisons intermoléculaires et intramoléculaires entre les macromolécules dans les tissus, offrant une excellente préservation des ultra-structures^{11 ,24,25,26}. Les échantillons biologiques sont sensibles à la température. Il est recommandé de réduire la mobilité latérale des protéines membranaires, de ralentir la diffusion des molécules intercellulaires et de ralentir le taux de fixation^11. Le temps nécessaire à la fixation des tissus dépend en grande partie de la taille de l’échantillon et de la vitesse à laquelle le fixatif se diffuse et réagit avec les composants de l’échantillon. Une fixation de nuit dans 4% de paraformaldéhyde ou 3% de glutaraldéhyde dans pbS à 4 oC est la méthode préférée pour l’analyse SEM des spécimens utilisés dans cette étude pour leurs propriétés pénétrantes séquentielles, qui permettent de traiter de plus petits échantillons délicats^{17 , 18} ans, états-unis qui ^{, 19 ans,} états-unis qui ^{, 20} Ans, états-unis ^{, 27}. Une étape post-fixation avec le tétroxide d’osmium est éliminée non seulement en raison de sa nature toxique, mais aussi en raison de sa nature toxique, mais aussi trouvé à mettre en œuvre aucun avantage supplémentaire pour améliorer la qualité de l’image pour les échantillons analysés dans cette étude.

Les échantillons biologiques contiennent des fluides qui interfèrent avec le fonctionnement du SEM; par conséquent, les échantillons doivent être séchés avant de l’insérer dans la chambre d’échantillon SEM. Une fois la déshydratation assurée, le solvant doit être retiré du tissu sans créer d’artefacts dans les spécimens en raison de la tension de surface/séchage. Trois méthodes de séchage différentes ont été couramment utilisées lors du traitement des tissus pour l’imagerie SEM: séchage à l’air, séchage point critique, et le gel des échantillons de séchage^28,29,30,31. Peu d’études rapportent que les trois méthodes de séchage produisent des résultats identiques avec des échantillons de tissus animaux^28,29,30,31. Une pratique générale utilisée pour les petits spécimens est la déshydratation chimique par la série de concentration ascendante de l’alcool et hexamethyldisilazane (HMDS), mais les spécimens plus grands sont séchés à l’aide d’un point critique de séchage (CPD) instrument³². Pendant le processus de séchage, des forces considérables se sont formées dans de petites cavités qui sont passées à travers le spécimen par une interface liquide/gaz; cela peut même conduire à un effondrement complet des structures creuses³³. Toute déformation due au traitement pourrait alors être confondue comme une caractéristique structurale indigène du spécimen. Ainsi, le phénomène généralisé pour le traitement devrait être éliminé et un processus de séchage unique devrait être normalisé pour chaque type de tissu particulièrement quand les spécimens délicats de tissu sont analysés.

Dans plusieurs essais menés à l’aide de diverses combinaisons de tous les processus mentionnés ci-dessus, nous avons normalisé les méthodes qui peuvent être utilisées pour l’analyse SEM de trois tissus délicats: embryons de reptiles, coquilles d’œufs de tortues peintes, et les cultures fongiques. Les biologistes et les morphologues développementaux décrivent la morphogénèse normale et anormale pendant le développement d’embryons chez les animaux vertébrés représentatifs. Les recherches sur les voies de signalisation génique dépendent de la description morphologique de structures nouvelles. Pour éviter tout changement brusque dans la structure de l’embryon vertébré au cours de l’analyse SEM, nous recommandons le séchage chimique après déshydratation. Le séchage chimique à l’aide du SDM est la méthode de séchage relativement récente et les avantages comprennent une rapidité relative, une facilité d’utilisation, une perte de coûts et l’expertise et l’équipement limités nécessaires⁹. La DPC est une technique de séchage couramment utilisée à l’aide de colsaging CO₂ à travers les spécimens à une température et une pression spécifiques. Nous avons identifié que le HMDS convient au séchage des tissus mous et délicats et permet de traiter de plus grands échantillons par rapport au séchage à points critiques, ce qui a causé une déformation importante des tissus embryonnaires. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour préparer des échantillons pour l’imagerie SEM afin d’étudier les caractéristiques morphologiques des champignons³⁴. Les spécimens fongiques sont généralement fixés dans le tétroxide d’osmium suivi de la déshydratation de l’éthanol et du séchage critique de point, qui peut fournir des résultats satisfaisants, bien que les effets toxiques du tétroxide d’osmium^6,7,35 et la perte de matériaux fongiques tout en changeant des solutions pendant le traitement sont des inconvénients prononcés. La technique de préparation des échantillons utilisant le séchage à l’air sans fixation a également été pratiquée^36, mais les résultats en structures rétrécies et effondrées, et l’observation de ces spécimens peut facilement être mal interprétée tout en caractérisant l’espèce. L’hypha fongique perd son intégrité au contact des liquides et un séchage uniforme peut ne pas être réalisé pour restaurer la structure. En raison de cet effet, le lyophilisation est couramment utilisé pour sécher les tissus mous comme le mycélium fongique. Le séchage par congélation fonctionne bien pour les matériaux propres, mais la présence de sels ou de sécrétion obscurcira les détails de surface qui ne seront identifiés qu’à l’étape d’observation de la SEM. Nous avons couplé la méthode de culture de diapositive avec la fixation de glutaraldéhyde et le séchage critique de point pour produire des détails structurels des hyphes et des spores fongiques intacts. Bien que le séchage de CPD ait causé le rétrécissement dans des embryons, il a eu comme conséquence les structures mycéliales bien préservées une fois couplées avec la fixation de glutaraldéhyde. La coquille d’œuf est d’une importance primordiale pour l’embryon d’animaux ovipares en agissant non seulement comme une couverture protectrice, mais aussi en fournissant une stabilité mécanique, la perméabilité au gaz et à l’eau, et une réserve de calcium pour l’embryon en développement. Les coquilles d’œufs de tortues d’eau douce sont classées comme « rigides » en fonction de leur structure, et en raison de leur disponibilité ont reçu une attention significative de la part des biologistes^1,2,3^{,4 , 5 Annonces , 6} Annonces ^{, 7 Annonces , 37 Ans,} états-unis ( ^{, 38}.

Nous détaillons des méthodes simples pour l’examen facile des membranes de coquille d’oeuf et de coquille de la tortue peinte qui peuvent être appliquées à n’importe quelle espèce rigide de coquille d’oeuf. Les méthodologies de préparation ont été évaluées en fonction de la qualité de l’image résultante et de la réduction des artefacts potentiels.