עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) אנליזה מבנית ותוספת הדמיה תאיים מיקרוסקופ אור ליצירת פרופיל תלת מימדי של prokaryotes, צמחים, ובעלי חיים. הרזולוציה המרחבית הגבוהה של ה-SEM הופכת אותו לאחת הטכניקות הרב-תכליתיות ורבת העוצמה ביותר הזמינות לבדיקה של מאפייני מיקרו-מבניים של דגימות בקנה מידה של מיקרומטר. דוגמאות מתייבשות נפתרות בפני מבנים טופוגרפיים ובעלי פרטים אינטנסיביים, המספקים את הבסיס לפיתוח מסקנות חוקיות בנוגע ליחסים פונקציונליים^{1,2,3 , ד ,} מיכל ^{5 ,} מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן ,} בן שמונה ^{, 9}. כאשר לפרש את התמונות SEM של דגימות ביולוגיות, זה אתגר גדול להבחין בין מבנים מקומיים ואת הפריטים שנוצרו במהלך העיבוד. SEM מופעל בדרך כלל בחללים גבוהים מאוד כדי למנוע כל התערבות של מולקולות גז המשפיעים על הראשי, משני או מפוזרים קורות אלקטרונים הנפלטים מן המדגם^10,11. כמו כן, חומרים ביולוגיים רגישים לפגיעה בקרינה בשל המאפיינים הירודים או הלא-מבצעים שלהם. זה חיוני עבור דגימות שנטענו אל SEM להיות יבש לחלוטין וחופשי של כל מזהמים אורגניים כדי לסלק כל החוצה אפשרי בסביבה ואקום גבוהה^10,11. כאשר דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר ממים, נדרשים טכניקות מורכבות נוספות כדי להבטיח שמבני הילידים יישמרו.

ההחלטה המתקבלת מבוססת על אופטימיזציה שיטות הכנה ספציפיים סוגי דגימה פרמטרים אינסטרומנטליים מנוצל. לכן, יש צורך להימנע משימוש בשלבי עיבוד כללית לכל סוגי הרקמות. כמה דגימות ביולוגיות ידרוש עיבוד מחמיר פחות כדי לשמר את המבנה שלהם בעוד זמן וטיפול יותר עשוי להיות צורך בסוגים עדינים של דגימות כדי למנוע את המבוא של חפצי ייבוש, כגון הצטמקות והתמוטטות. הכנה לדוגמה היא שלב קריטי בהדמיית SEM; ממצאי מחקרים מורמטרים מושפעים במידה ניכרת מהליכי הכנה לדגימה^12,13. שלבי ההכנה המשותפים לדגימות ביולוגיות רבות הן קיבעון, התייבשות וציפוי במתכת כגון זהב, פלטינה או פלדיום כדי להמיר את משטחי הגוף שלהם כדי להיות מוליך לניתוח SEM. האופי והשילוב של השלבים המשמשים ישתנה בהתאם לסוג הרקמה, ולמטרות הספציפיות של המחקר. חיוב הצטברות, רגישות לואקום ולנזק קרן אלקטרוני להוות בעיות בעת עיבוד דגימות ביולוגיות עדין רך, המחייב שלבי עיבוד נוספים כדי לשמור על מבנה מקורי של האובייקט. באמצעות שיטות קונבנציונליות כגון אוסמיום tetroxide תיקון, והתייבשות לגרום הצטמקות ואת התמוטטות של רקמות עדינות^14,15,16,17. מטרת המחקר היא להקים מתודולוגיות אלגנטיות הנגזרות משילוב רעיונות ממחקרים קודמים עם שינויים להכנה ותמונה של רקמות עדינות רכות (למשל, עוברי זוחלים, קליפת ביצה של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי).

בחירת שיטת תיקון מתאימה היא הצעד החשוב ביותר לניתוח מיקרוסקופי של דגימות ביולוגיות. תיקון הרקמות מיד לאחר בידוד מאורגניזם הוא חיוני כדי למנוע שינוי במבנה שלהם בשל התפרקות. קבע יעילה צריך לסיים תהליכים סלולריים על ידי הסטת התאים במהירות ושמירה על האפקט באופן הפיך כדי לייצב את מבנה המדגם כדי לעמוד בשני שלבי העיבוד הבאים ובדיקה תחת SEM^{17 , 18}. למרות מספר שיטות הקיבעון הכימי והפיזי ידועים, קיבעון כימי הוא נפוץ יותר עבור דגימות ביולוגיות כדי למנוע כל שינוי הסלולר עקב אוטוליזיס, ריקבון, והשפעות ייבוש. קיימות ניסוחים כימיים מרובים קבע שנדונו בספרות^{17,19,20,21,22,23}, תיקונים שפועלים על ידי מדהרפתקאות ו קרו קרוש ביולוגית, ואלה שפותרים על ידי הקרו מקושרת באמצעות החוצה. האלכוהול משמשים לטיפול במיקרוסקופיה ששמרו על מבנה האולטרסאונד בצורה מאוד גרועה ומשמשים בעיקר למיקרוסקופ אור ולא מומלץ לניתוח אלקטרון מיקרוסקופי. הקושרות בין התיקונים האחרים כמו פורמלדהיד, גלוטרלדהיד ואוסמיום tetroxide יוצרים מחתך מולקולרי ומולקולרי בין הקרו בתוך הרקמות, ומספקים שימור מצוין של מבנים אולטרה-מימריים^{11 ,24,25,26}. דגימות ביולוגיות רגישות לטמפרטורה. הטמפרטורה בתחילת קיבעון מומלץ להיות 4 ° צ’ כדי להפחית את הניידות לרוחב של חלבונים ממברנה, כדי להאט את הדיפוזיה של מולקולות התרבות, ולהאט את שיעור הקיבעון¹¹. הזמן הנדרש לתיקון רקמות תלוי במידה רבה בגודל של המדגם ואת המהירות שבה הקיבעון מפזרת ומגיב עם המרכיבים של הדגימה. קיבעון לילה ב 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטאלדהיד ב-PBS ב-4 ° c היא השיטה המועדפת עבור ניתוח SEM של דגימות המשמשות במחקר זה עבור מאפייני החדירה הרציפה שלהם, אשר מאפשרים דגימות עדינות קטנות יותר לעיבוד^{17 ,} מיכל ^{בן 18 ,} מיכל ^{בן 19 ,} מיכל בן ^{20 , 27}. צעד לאחר קיבוע עם אוסמיום tetroxide מסולק לא רק בשל טבעו הרעיל אלא גם מצא ליישם שום יתרון נוסף כדי לשפר את איכות התמונה עבור דגימות שנותחו במחקר זה.

דגימות ביולוגיות מכילות נוזלים המפריעים לפעולת SEM; מכאן, הדגימות צריך להתייבש לפני הכנסתו לתא לדוגמה SEM. לאחר התייבשות מובטחת, את הממס יש להסיר מן הרקמה מבלי ליצור ממצאים לתוך הדגימות בשל מתח פני השטח/ייבוש. שלוש שיטות ייבוש שונות היו בשימוש נפוץ במהלך רקמות עיבוד עבור הדמיה SEM: ייבוש האוויר, במצב קריטי ייבוש, ו להקפיא הקפאה דגימות^28,29,30,31. מחקרים מעטים מדווחים על שלוש שיטות הייבוש המייצרות תוצאות זהות עם דגימות רקמה בעלי חיים^28,29,30,31. תרגול כללי המשמש לדגימות קטנות יותר הן התייבשות כימית על-ידי סדרת הריכוז העולה של אלכוהול ו-הבוחנים (HMDS), אך דגימות גדולות יותר מיובשות באמצעות מכשיר לייבוש בנקודה קריטית (CPD)³². בתהליך הייבוש, כוחות ניכרים הנוצרים בחללים קטנים העוברים דרך הדגימה באמצעות ממשק נוזלי/גז; זה יכול אפילו לגרום לקריסה מלאה של המבנים חלול³³. כל דפורמציה המתרחשים בשל הטיפול יכול להיות טועה כתכונה מבנית יליד של הדגימה. לפיכך, התופעה הוכללת לעיבוד יש לסלק ותהליך ייבוש ייחודי צריך להיות מתוקננת עבור כל סוג של רקמה במיוחד כאשר דגימות רקמה עדינה מנותח.

בכמה מבחנים שנערכו באמצעות שילוב שונים של כל התהליכים הנ ל, אנו מתוקננת את השיטות שניתן להשתמש בהן עבור ניתוח SEM של שלוש רקמות עדינות: עוברי זוחלים, קליפות בביצים של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי. ביולוגים ומורפוללוגים התפתחותיים מתארים מורפולגנזה נורמלית ובלתי נורמלית במהלך התפתחות העובר בבעלי חוליות מייצגים. חקירות על המסלולים גנטי איתות תלוי בתיאור מורפולוגית של מבנים חדשניים. כדי למנוע כל שינוי פתאומי במבנה העובר בעלי חוליות במהלך ניתוח SEM, אנו ממליצים על ייבוש כימי בעקבות התייבשות. ייבוש כימי באמצעות HMDS היא שיטת הייבוש החדשה יחסית והיתרונות כוללים מהירות יחסית, קלות שימוש, אובדן עלות, ואת המומחיות מוגבלת וציוד צריך⁹. CPD היא טכניקת ייבוש בשימוש נפוץ באמצעות passaging CO₂ על פני הדגימות בטמפרטורה מסוימת ולחץ. זיהינו כי HMDS מתאים לייבוש רקמות עדינות רכות ומאפשר דגימות גדולות יותר להיות מעובד בהשוואה נקודה קריטית ייבוש, אשר גרם דפורמציה נרחבת רקמות עובריים. מספר שיטות שימשו כדי להכין דגימות עבור הדמיה SEM כדי ללמוד את המאפיינים מורפולוגיים של פטריות³⁴. דגימות פטרייתי הם בדרך כלל קבוע ב אוסמיום tetroxide ואחריו התייבשות אתנול ובנקודה קריטית ייבוש, אשר עשוי לספק תוצאות משביעות רצון, למרות ההשפעות הרעילות של אוסמיום tetroxide^6,7,35 ולאבד חומרים פטרייתיים תוך שינוי פתרונות במהלך העיבוד מבטאים חסרונות. טכניקת ההכנה לדוגמה באמצעות ייבוש האוויר ללא קיבעון היתה גם התאמן³⁶ אבל התוצאות של מבנים צומק ו התמוטט, ותצפית של דגימות כאלה יכול בקלות להיות מפורש בזמן אפיון המינים. Hypha פטרייתי מאבד את שלמות במגע עם נוזלים ואף ייבוש לא ניתן להשיג כדי לשחזר את המבנה. בשל השפעה זו, ייבוש ההקפאה משמש בדרך כלל לייבוש רקמות רכות כמו פטריות מיצליום. ייבוש ההקפאה עובד היטב חומרים נקיים, אבל הנוכחות של מלחים או הפרשה יהיה לטשטש פרטי השטח כי יזוהו רק בשלב הצפייה SEM. אנו מצמידים את שיטת תרבות השקופיות עם תיקון glutarאלדהיד ואת הנקודה הקריטית ייבוש כדי להניב פרטים מבניים של מיקוף פטרייתי שלמים ונבגים. למרות CPD ייבוש הצטמקות העוברים, זה הביא גם מבנים mycelial היטב כאשר ביחד עם קיבעון גלוטרלדהיד. קליפת המעטפת היא בעלת חשיבות עיקרית לעובר בעלי חיים בלתי-מכניים על-ידי הפעלת כיסוי הגנתי, אלא גם מתן יציבות מכנית, חדירות לגז ומים, ושמורת סידן לעובר המתפתח. כדורי הביצה של צב המים המתוקים מסווגים כ”קשיחים” המבוססים על המבנה שלהם, ובגלל זמינותם קיבלו תשומת לב משמעותית מהביולוגים^{1,2,3,4 ,} מיכל ^{5 ,} מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן , 37 , 38}.

אנו לפרט שיטות פשוטות לבדיקה קלה של קרום קליפת הקליפה של צב צבוע שניתן להחיל על כל מיני ביצה נוקשה. מתודולוגיות הכנה הוערכו על בסיס איכות התמונה וכתוצאה מכך מופחתת חפצים פוטנציאליים.