Обработка эмбриона, яичной скорлупы и грибковой культуры для сканирования электронной микроскопии

Сканирующий электронный микроскоп (SEM) ультраструктурный анализ и внутриклеточные изображения дополняют световую микроскопию для трехмерного профилирования прокариот, растений и животных. Высокое пространственное разрешение SEM делает его одним из самых универсальных и мощных методов, доступных для изучения микроструктурных характеристик образцов на нанометре до микрометрового масштаба. Высохшие образцы решаются композиционных и топографических структур с интенсивной детализацией, что обеспечивает основу для разработки достоверных выводов о функциональных отношениях^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9}. При интерпретации SEM изображения биологических образцов, это большая проблема, чтобы различать родные структуры и артефакты, которые создаются во время обработки. SEM, как правило, работает на очень высоком вакууме, чтобы избежать каких-либо помех от молекул газа, влияющих на первичные, вторичные или backscattered электронных лучей, испускаемых из образца^10,11. Кроме того, биологические материалы подвержены радиационному повреждению из-за их неудовлетворительных или непроводящих свойств. Очень важно для образцов, загруженных в SEM, чтобы быть полностью сухим и свободным от каких-либо органических загрязняющих веществ, чтобы устранить любые возможные outgassing в условиях высокой вакуумной среды^10,11. Поскольку биологические образцы в основном состоят из воды, необходимы дополнительные методы подготовки для обеспечения сохранения местных структур.

Полученное разрешение основано на оптимизации методов подготовки, характерных для используемых типов образцов и инструментальных параметров. Таким образом, необходимо избегать использования обобщенных шагов обработки для всех типов тканей. Некоторые биологические образцы потребуют менее строгой обработки, чтобы сохранить свою структуру, в то время как для деликатных типов образцов может потребоваться больше времени и заботы, чтобы избежать введения артефактов сушки, таких как усадка и коллапс. Подготовка образцов является важным шагом в визуализации SEM; результаты морфометрических исследований удивительно подвержены влиянию процедур подготовки образцов^12,13. Общие шаги подготовки для многих биологических образцов фиксации, обезвоживания и покрытия с металлом, таких как золото, платина или палладий, чтобы преобразовать их поверхности, чтобы быть проводящих для анализа SEM. Характер и сочетание используемых шагов будет варьироваться в зависимости от типа ткани, и конкретные цели исследования. Наращивание заряда, чувствительность к повреждению вакуумного и электронного луча создают проблемы при обработке мягких нежных биологических образцов, что требует дополнительных этапов обработки для сохранения родной структуры объекта. Используя обычные методы, такие как фиксация тетроксида осмия и обезвоживание вызывают усадку и коллапс тонких тканей^14,15,16,17. Целью исследования является создание элегантных методологий, полученных путем объединения идей из более ранних исследований с модификациями для подготовки и изображения мягких тонких тканей (например, эмбрионы рептилий, яичная скорлупа окрашенных черепах и грибковых культур).

Выбор подходящего метода фиксации является первым наиболее важным шагом для микроскопического анализа биологических образцов. Фиксация тканей сразу после изоляции от организма имеет важное значение для предотвращения изменения в их морфологии из-за разложения. Эффективный фиксатор должен прекратить клеточные процессы, быстро пронизывающие клетки и сохраняя эффект необратимо, чтобы стабилизировать структуру образца, чтобы выдержать как последующие шаги обработки, так и экспертизу в рамках SEM^{17 , 18}. Хотя некоторые химические и физические методы фиксации известны, химическая фиксация чаще используется для биологических образцов, чтобы избежать каких-либо клеточных изменений из-за автолиза, гнилости и сушки эффектов. Существуют многочисленные фиксаторные химические формулировки, обсуждаемые в литературе^{17,19,20,21,22,23}, фиксаторы, которые работают путем денатурирования и коагуляние биологических макромолекулов, и те, которые фиксируют ковалентно перекрестных связывания макромолекулы. Алкоголь используется в качестве денатурирующим фиксации, которые очень плохо сохраняют ультраструктуру и используются в основном для световой микроскопии и не рекомендуется для электронного микроскопического анализа. Перекрестные фиксаторы, такие как формальдегид, гюйтаральдегид и тетроксид осмия создают межмолекулярные и внутримолекулярные перекрестные связи между макромолекулами в тканях, обеспечивая превосходное сохранение ультраструктур^{11 ,24,25,26}. Биологические образцы чувствительны к температуре. Температура в начале фиксации рекомендуется быть 4 градуса По Цельсию, чтобы уменьшить боковую подвижность мембранных белков, замедлить диффузию межклеточных молекул, а также замедлить скорость фиксации¹¹. Время, необходимое для фиксации тканей во многом зависит от размера образца и скорости, с которой фиксатор рассеивается и реагирует с компонентами образца. Ночная фиксация в 4% параформальдегида или 3% глютаральдегида в PBS при 4 градусах по Цельсию является предпочтительным методом для АНАЛИЗА SEM образцов, используемых в данном исследовании для их последовательных проникающих свойств, которые позволяют более мелкие деликатные образцы, которые будут обработаны^{17 , 18 лет , 19 лет , 20 , 27}. Пост-фиксация шаг с тетроксидом осмия устраняется не только из-за его токсического характера, но и найти для реализации не дополнительное преимущество для улучшения качества изображения для образцов, проанализированных в этом исследовании.

Биологические образцы содержат жидкости, которые мешают операции SEM; следовательно, образцы должны быть высушены, прежде чем вставлять его в камере образца SEM. После того, как обезвоживание обеспечивается, растворитель должен быть удален из ткани без создания артефактов в образцы из-за поверхностного натяжения / сушки. Три различных метода сушки были широко использованы при обработке тканей для SEM изображений: сушка воздуха, критической точки сушки, и заморозить сушки образцов^28,29,30,31. Немногие изучения сообщают все 3 метода сушки производя идентичные результаты с образцами ткани животных^28,29,30,31. Общая практика, используемая для небольших образцов химического обезвоживания, восходящей концентрации серии алкоголя и гексаметилдизилазан (HMDS), но более крупные образцы сушатсивается с помощью критической точки сушки (CPD) инструмент³². В процессе сушки значительные силы образуются в небольших полости, которые проходят через образец с помощью жидкого/газового интерфейса; это может даже привести к полному коллапсу полых структур³³. Любая деформация, возникающая из-за лечения, может быть ошибочно принята как родная структурная особенность образца. Таким образом, обобщенный феномен обработки должен быть ликвидирован и уникальный процесс сушки должен быть стандартизирован для каждого типа ткани, особенно при анализе деликатных образцов ткани.

В нескольких исследованиях, проведенных с использованием различных комбинаций всех вышеупомянутых процессов, мы стандартизировали методы, которые могут быть использованы для SEM анализа трех тонких тканей: эмбрионов рептилий, яичной скорлупы окрашенных черепах и грибковых культур. Биологи и морфологи описывают нормальный и аномальный морфогенез во время развития эмбриона у репрезентативных позвоночных животных. Исследования по пути генной сигнализации зависят от морфологического описания новых структур. Чтобы избежать резких изменений в структуре эмбриона позвоночных во время анализа SEM, мы рекомендуем химическую сушку после обезвоживания. Химическая сушка с использованием HMDS является относительно новейшим методом сушки и преимущества включают относительную быстроту, простота использования, потери стоимости, а также ограниченный опыт и оборудование, необходимые⁹. CPD является широко используемой техникой сушки с использованием проходного CO₂ через образцы при определенной температуре и давлении. Мы определили, что HMDS подходит для сушки мягких тонких тканей и позволяет более крупные образцы для обработки по сравнению с критической точки сушки, что вызвало обширную деформацию эмбриональных тканей. Несколько методов были использованы для подготовки образцов для SEM изображений для изучения морфологических характеристик грибов³⁴. Грибковые образцы обычно фиксируются в тетроксид осмия следуют обезвоживание этанола и критической точки сушки, которые могут обеспечить удовлетворительные результаты, хотя токсическое воздействие тетроксида осмия^6,7,35 и потеря грибковых материалов при изменении растворов во время обработки являются явными недостатками. Метод подготовки образца с использованием сушки воздуха без фиксации также практикуется^36, но приводит к сморщенным и рухнувшим структурам, и наблюдение за такими образцами может быть легко неправильно истолковано при характеристике вида. Грибковые гифы теряет свою целостность в контакте с жидкостями и даже сушки не может быть достигнуто для восстановления структуры. Из-за этого эффекта, замораживание сушки обычно используется для сушки мягких тканей, как грибковый мицелий. Замораживание сушки хорошо работает для чистых материалов, но наличие каких-либо солей или секреции будет скрывать детали поверхности, которые будут определены только на стадии просмотра SEM. Мы соединили метод культуры слайдов с фиксацией гюмтараальдегида и критической точкой сушки, чтобы получить структурные детали нетронутых грибковых гифи и спор. Хотя сушка CPD вызвала усадку эмбрионов, она привела к хорошо сохранившимся мицелеевым структурам в сочетании с фиксацией глютаральдегида. Яичная скорлупа имеет первостепенное значение для эмбриона овипарных животных, не только действуя в качестве защитного покрытия, но и обеспечивая механическую стабильность, проницаемость газа и воды, а также запас кальция для развивающегося эмбриона. Пресноводные черепахи яичной скорлупы классифицируются как “жесткие” в зависимости от их структуры, и из-за их наличия получили значительное внимание от биологов^{1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 (г. , 37 , 38}.

Мы подробно простые методы для легкого изучения яичной скорлупы и оболочки мембраны окрашены черепахи, которые могут быть применены к любой жесткой яичной скорлупы видов. Методологии подготовки оценивались на основе полученного качества изображения и сокращения потенциальных артефактов.