Этот протокол демонстрирует анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов, синий родной полиакриламидный гель-электрофорез. Здесь описан метод, применяемый для культивируемых клеток человека.
Митохондриальное дыхание осуществляется комплексы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в митохондриях. Внутренние и экологические факторы могут повлиять Ассамблеи и стабильность OXPHOS комплексов. Этот протокол описывает Анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов, синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-страница) в приложении для культивируемых клеток человека. Во-первых митохондрии извлекаются из клетки, с помощью digitonin, а затем с помощью maltoside лаурилсульфат, нетронутыми OXPHOS комплексы изолированы от митохондриальной мембраны. OXPHOS комплексы, затем решаются градиента гель-электрофорез в присутствии отрицательно заряженных краситель, Кумасси синий, который препятствует агрегации белков и гарантирует электрофоретической подвижности белковых комплексов к катоду. Наконец OXPHOS комплексы определяются стандартные immunoblotting. Таким образом BN-страница является удобный и недорогой метод, который может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов, в отличие от основных SDS-PAGE, позволяя исследование только отдельные OXPHOS комплекс субъединиц.
Митохондрии являются многофункциональными органеллы, играет важную роль в производстве энергии, регуляции клеточного метаболизма, сигнализаторы, апоптоз, старение,2,1,и т.д.3. Производство энергии в митохондриях полагается на функции окислительного фосфорилирования, пары дыхания с синтез АТФ. В клетках человека митохондриальных Оксидативное фосфорилирование системы (OXPHOS) состоит из пяти комплексов. Комплексы-IV создание электрохимических протонного градиента в пространстве митохондриальных межмембранное, который используется для производства АТФ, комплекс V. Каждый комплекс OXPHOS-multimeric и, за исключением комплекс II, состоящий из субъединиц, кодируется как ядерных, так и митохондриальных генов. Любые дефекты в основные компоненты OXPHOS комплексов, вызванные мутации или экологический стресс может повлиять Ассамблеи и функциональность системы окислительного фосфорилирования. Кроме того надлежащее Ассамблея функциональных комплексов OXPHOS требуется большое количество Ассамблеи факторы4,5,6.
Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является включение анализа нетронутыми белковых комплексов фундаментальных техника и могут быть использованы для изучения Ассамблея OXPHOS комплексов. Во-первых митохондрии изолированы от клеток, digitonin, который является мягким моющим средством, которое permeabilizes плазматической мембраны клеток. Затем используя maltoside лаурилсульфат, OXPHOS комплексы освобождаются от митохондриальной мембраны. С помощью градиента электрофорез, OXPHOS комплексы разделены согласно их массы. Кумасси синий G-250 (не R-250) добавлены в буфер образца и синий катод буфера разъединяет моющее средство лабильного ассоциаций, но сохраняет отдельные дыхательной цепи комплексы нетронутыми8. Во время электрофорез синий катод буфер, содержащий краситель заменяется на катод буфера без красителя, который обеспечивает эффективную передачу OXPHOS комплексов PVDF мембрану8. Чтобы визуализировать OXPHOS комплексов, PVDF мембрану последовательно инкубировали с антителами, соответствующие выбранной подразделений пяти OXPHOS комплексов.
Метод, описанный здесь, с некоторыми изменениями может применяться к любой культивируемых клеток. Кроме того этот метод может использоваться для анализа OXPHOS комплексов в митохондриях, изолированных от образцов ткани9. BN-страница требует по крайней мере 5-10 мкг митохондрий для каждого образца, в перспективе. Используя метод, описанный здесь, 500000 культивируемых клеток, таких как HEK293, SH-SY5Y или 143B клетки могут принести около 10 мкг митохондрий. Однако достаточное количество клеток для анализа млрд зависит от типа конкретные ячейки.
Наиболее распространенным способом для изучения белков митохондриальных OXPHOS, SDS-PAGE и Западный blotting. Однако SDS-PAGE позволяет изучать только отдельные подразделения OXPHOS и, в отличие от БН-страницы, не может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов. Ясно, родной страница отделяет белковых комплексов в родной условий отрицательно заряженных красителя без присутствия и имеет значительно более низкое разрешение по сравнению с БН-страницы. Однако ясно родной страница мягче, чем BN-страницы так, что он может сохранить лабильной супрамолекулярные сборки белковых комплексов, таких как OXPHOS supercomplexes, которые отделены под условия BN-страница10. В этом протоколе градиент гель используется для разделения комплексов; Однако в качестве альтернативы,-градиент разделения может использоваться если относительно дорогих градиента maker является не наличие11.
Важно, в описанный здесь метод позволяет анализировать Ассамблея OXPHOS комплексов, в то время как функциональность комплексов не оценивается. Высоким разрешением BN-страница следуют в гель деятельности пробирного11 , а также пробирного спектрофотометрические ферментативной активности митохондриальных комплексов12 являются эффективные методы для функционального анализа OXPHOS комплексов. Однако оба этих методов не пробирного Ассамблея OXPHOS комплексов.
Таким образом BN-страница является оптимальный метод расследовать Ассамблея отдельных OXPHOS комплексов. Например некоторые митохондриальных расстройств, таких как Лебер наследственной оптической невропатии (LHON), митохондриальных энцефалопатия с молочно-кислый ацидоз и инсульта подобных эпизодов (MELAS), связаны с изменены Ассамблеей одного или более компонентов OXPHOS система5. С помощью BN-страницы метод, описанный здесь, могут быть изучены молекулярных механизмов митохондриальных болезней.
Одним из наиболее важных частей протокола является сохранить нетронутыми OXPHOS комплексов во время подготовки проб, хранения и электрофорез геля. Таким образом митохондрии, должен быть изолирован на + 4 ° C и образцов не должен пройти циклов замораживания оттаивания. OXPHOS комплексы допускает только один цикл замораживания оттаивания в течение всей процедуры. Несколько циклов замораживания оттаивания уничтожить OXPHOS комплексов (рис. 1B). Управления и экспериментальных образцов, которые необходимо сравнить должны быть готовы параллельно избежать каких-либо различий в условиях хранения, которые могут дать результаты заблуждение. Если это не возможно для выполнения всех шагов протокола параллельно с всех образцов, мы рекомендуем заморозить промывают клеток окатышей на-80 ° C (шаг 1.4 в этом протоколе) и позднее выполнять остальные протокола для всех образцов вместе по крайней мере до elec гель trophoresis. Особое внимание должно уделяться чистоты электрофорез аппарата (танк, кассета). Если же аппарат используется для SDS-PAGE, очень хорошо Вымойте перед BN-страницы. Любые остаточные ИКБ может привести к диссоциации OXPHOS комплексов во время электрофореза.
Высокое качество градиента гели являются другой важной частью протокола. Сборный гели для голубой родной страницы являются коммерчески доступными; Однако это не рекомендуется использовать их, поскольку буферов, используемых для коммерческих гели могут иметь состав, который отличается от образца буферов. Градиент геля использованы здесь (6-15%) является оптимальным для разделения отдельных OXPHOS комплексов. Чтобы обнаружить более высокого порядка супрамолекулярные структуры OXPHOS, также известный как дыхательной цепи supercomplexes14, некоторые оптимизации является требуется11.
Для визуализации OXPHOS комплексы используют специфические антитела последовательно, на основе их свойств. Например используйте сначала антител, что последний дает слабый сигнал и антитела с наиболее сильным сигналом. Это важно, поскольку зачистки ослабляет обнаружения (рис. 1 d). Состав комплексов дыхательной цепи могут быть исследованы, если после BN-страница геля подвергается второго измерения SDS-PAGE15.
Протокол, описанные здесь предполагает последовательно с использованием антител против отдельных OXPHOS комплексов. Однако коммерчески доступных OXPHOS антитела коктейль может использоваться для обнаружения всех пяти OXPHOS комплексы одновременно. Тем не менее чтобы иметь возможность обнаружить неполно собрал OXPHOS комплексов и определить их самобытности, антитела против отдельных комплексов OXPHOS должен использоваться последовательно. Этот шаг является длительным; Однако это может быть важно для тестирования новых экспериментальных условий и моделей.
Концентрация digitonin, используемых для митохондриального изоляции должна быть оптимизирована для конкретной ячейки типа. Как моющее средство digitonin permeabilizes клеточной мембраны. Оптимальная концентрация digitonin эффективно permeabilizes плазматической мембраны клеток, оставляя нетронутыми митохондриальной мембраны. Слишком низкая концентрация digitonin вызывает высокое загрязнение митохондриальной экстрактов, пока слишком высокая концентрация повреждения митохондриальных мембран и уменьшает общее митохондриальной доходность. Оптимальное digitonin/белков соотношение (g/g) колеблется от 0,3 до 1. Западный анализ помаркой белков, извлеченные из окатышей и supernatants может использоваться для тестирования оптимальная концентрация digitonin16.
Этот протокол не содержит белка загрузки элемента управления на immunoblot; Таким образом концентрация белка извлеченные комплексов следует тщательно оценивать по крайней мере в triplicates для обеспечения равных загрузки. Кроме того образцы можно запустить в БН-страницы в реплицирует. Если Ассамблея селективного OXPHOS комплексов нарушается, неизменным комплексов может служить в качестве управления загрузки.
Оценка молекулярной массы белковых комплексов в БН-страница является сложной задачей,18. Текущий протокол не включают в себя маркер молекулярного веса; Таким образом чтобы оценить Ассамблея OXPHOS комплексов, контрольные образцы, содержащие не влияет комплексов должен всегда быть включен в анализ. Контрольные образцы для БН-страницы, как правило, неочищенные или дикого типа клеток.
Метод, представленный здесь оптимизирован для обнаружения дыхательной цепи митохондрий комплексов; Однако он также может применяться для оценки олигомеризации митохондриальных протеинов19. Кроме того Ассамблея ставка OXPHOS комплексов могут быть изучены первый озоноразрушающие митохондриальной кодировке Субблок содержащие комплексы, хлорамфеникола и затем после их восстановления после удаления хлорамфеникола10. Таким образом BN-страница может использоваться для оценки уровня устойчивого состояния и Ассамблеи OXPHOS для различных приложений, включая молекулярной диагностики человека митохондриальных нарушений9,11.
The authors have nothing to disclose.
Библиотека университета Хельсинки поблагодарил за финансовую поддержку в публикации.
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |