Dieses Protokoll zeigt die Analyse der mitochondrialen Atmungskette komplexe durch blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese. Hier wird die Methode angewendet, kultivierten menschlichen Zellen beschrieben.
Mitochondriale Atmung erfolgt durch Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) komplexe innerhalb der Mitochondrien. Interne und Umweltfaktoren können die Montage und die Stabilität des OXPHOS-Komplexe durcheinanderbringen. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der mitochondrialen Atmungskette komplexe durch blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) in Anwendung auf kultivierten menschlichen Zellen. Mitochondrien von den Zellen mittels Digitonin extrahiert werden, zunächst mit Natriumlaurylsulfat Maltosid intakt OXPHOS-Komplexe sind von der mitochondrialen Membranen isoliert. Die OXPHOS-Komplexe sind dann durch Gradienten Gelelektrophorese in Anwesenheit der negativ geladenen Farbstoff Coomassie Blau, gelöst, die verhindert Proteinaggregation und sorgt für elektrophoretische Mobilität Proteinkomplexe in Richtung der Kathode. Zu guter Letzt werden die OXPHOS-Komplexe vom standard Immunoblotting erkannt. BN-Seite ist also eine bequeme und preiswerte Technik, die verwendet werden kann, um die Montage der gesamten OXPHOS-Komplexe, im Gegensatz zu den grundlegenden SDS-PAGE erlaubt die Studie nur einzelne OXPHOS Komplexe Untereinheiten zu bewerten.
Mitochondrien sind multifunktionale Organellen spielen eine wichtige Rolle bei der Energiegewinnung, Regulierung des Zellstoffwechsels, Signaltechnik, Apoptose, Alterung, etc.1,2,3. Die Energieproduktion in den Mitochondrien stützt sich auf die Oxidative Phosphorylierung-Funktion, die Atmung mit der ATP-Synthese Paare. In menschlichen Zellen besteht die Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung System (OXPHOS) aus fünf komplexe. Komplexe I bis IV erstellen eine elektrochemischen Proton Steigung in den mitochondrialen Intermembran Raum, der durch komplexe V verwendet wird, um ATP zu produzieren. Jede komplexe OXPHOS ist Multimeric und außer Komplex II, bestehend aus den Untereinheiten von Kern- und mitochondriale Gene kodiert. Mängel in der Kernkomponenten der OXPHOS-Komplexe, die durch Mutationen oder Umweltstress können die Montage und die Funktionalität des Systems Oxidative Phosphorylierung durcheinanderbringen. Darüber hinaus erfordert die richtige Montage der funktionalen OXPHOS-Komplexe eine große Anzahl von Montage Faktoren4,5,6.
Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine grundlegende Technik ermöglicht Analyse von Proteinkomplexen intakt und kann verwendet werden, um die Montage der OXPHOS-Komplexe zu studieren. Erstens sind Mitochondrien isoliert aus den Zellen von Digitonin, ein mildes Reinigungsmittel, das die Plasmamembran der Zellen permeabilizes. Dann werden mithilfe von Natriumlaurylsulfat Maltosid OXPHOS-Komplexe aus den mitochondrialen Membranen freigegeben. Mithilfe von Gradienten Gelelektrophorese werden die OXPHOS-Komplexe nach ihrer Masse getrennt. Coomassie Blau G-250 (nicht R-250) der Probenpuffer und den blauen Kathode Puffer hinzugefügt distanziert sich Waschmittel-labile Verbände aber individuelle Atmungskette komplexe intakt8bewahrt. Während der Elektrophorese wird der blauen Kathode-Puffer mit Farbstoff von der Kathode Puffer ohne Farbstoff, sorgt für effiziente Übertragung der OXPHOS-Komplexe an der PVDF-Membran-8ersetzt. Um OXPHOS-Komplexe zu visualisieren, ist die PVDF-Membran sequenziell mit Antikörpern, die entsprechend der gewählten Untereinheiten der fünf OXPHOS Komplexe inkubiert.
Mit einigen Änderungen hier beschriebene Methode kann auf alle kultivierten Zellen angewendet werden. Darüber hinaus kann diese Methode für die Analyse der OXPHOS-Komplexe in den Mitochondrien von Gewebe Proben9isoliert verwendet werden. BN-Seite benötigt mindestens 5-10 µg von Mitochondrien für jede Probe pro Durchlauf. Mit der beschriebenen Methode hier, 500.000 kultivierte Zellen wie HEK293, SH-SY5Y oder 143B Zellen können Ausbeute ca. 10 µg der Mitochondrien. Allerdings hängt eine ausreichende Menge der Zellen für die BN-Analyse von bestimmten Zelltyp.
Die am häufigsten verwendete Methode zur mitochondrialen OXPHOS-Proteine zu studieren ist SDS-PAGE und westliche Beflecken. SDS-PAGE jedoch kann nur einzelne OXPHOS-Untereinheiten zu studieren und im Gegensatz zu den BN-Seite kann nicht verwendet werden, um die Montage des gesamten OXPHOS-Komplexe zu bewerten. Klar Native-Seite trennt Proteinkomplexe in native Bedingungen ohne die Anwesenheit von negativ geladenen Farbstoff und hat eine deutlich niedrigere Auflösung im Vergleich zu BN-Seite. Klar Native-Seite ist jedoch milder als BN-Seite, so dass es labile supramolekulare Baugruppen von Proteinkomplexen wie OXPHOS Supercomplexes behalten kann, die unter den BN-Seite Bedingungen10getrennt sind. In diesem Protokoll wird der gradient Gel verwendet, um komplexe zu trennen; jedoch kann alternativ-Gradient Trennung verwendet werden, wenn der relativ teure Farbverlauf Maker nicht verfügbar11ist.
Wichtig ist, die hier beschriebene Methode erlaubt die Montage des OXPHOS-Komplexe, zu analysieren, während die Funktionalität der Anlagen nicht bewertet wird. Eine hochauflösende BN-Seite gefolgt von in-Gel-Aktivität Assay11 sowie spektralfotometrische enzymatische Aktivität Assay der mitochondrialen komplexe12 sind effiziente Techniken für die Funktionsanalyse der OXPHOS-Komplexe. Jedoch beide Methoden nicht die Versammlung des OXPHOS-Komplexe assay.
BN-Seite ist somit die optimale Methode, um die Montage der einzelnen OXPHOS-Komplexe zu untersuchen. Zum Beispiel sind einige mitochondrialen Erkrankungen, wie z. B. Leber hereditäre optische Neuropathie (LHON), mitochondriale Enzephalopathie mit Laktatazidose und Schlaganfall-ähnlichen Episoden (MELAS), veränderte Assembly eine oder mehrere Komponenten von der OXPHOS zugeordnet System5. Mithilfe der beschriebenen Methode der BN-Seite hier, können die molekularen Mechanismen der mitochondrialen Erkrankungen untersucht werden.
Eines der wichtigsten Teile des Protokolls ist zur Erhaltung intakter OXPHOS-Komplexe während der Probenvorbereitung, Lagerung und gel-Elektrophorese. So Mitochondrien sollte bei + 4 ° C isoliert werden und die Proben sollten nicht Frost-Tau-Zyklen durchlaufen. OXPHOS-Komplexe verträgt nur einem Gefrier-Tau-Zyklus während des gesamten Verfahrens. Mehreren Gefrier-Tau-Zyklen zerstören OXPHOS-Komplexe (Abbildung 1 b). Kontrolle und experimentellen Proben, die verglichen werden sollen sollte parallel vorbereitet werden, um Unterschiede in der Lagerung zu vermeiden, die irreführende Ergebnisse geben könnte. Wenn es nicht möglich, alle Schritte des Protokolls mit den Proben parallel auszuführen ist, empfehlen wir, gewaschene Zelle Pellets bei-80 ° C (Schritt 1.4 in diesem Protokoll) Einfrieren und später tragen Sie den Rest des Protokolls für alle Proben zusammen mindestens bis Gel elec Trophoresis. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Sauberkeit der Elektrophorese-Apparatur (Tank, Kassette). Wenn das gleiche Gerät für SDS-PAGE verwendet wird, waschen Sie es sehr gut vor BN-Seite. Alle restlichen SDS kann dazu führen, dass Dissoziation der OXPHOS-Komplexe während der Elektrophorese.
Qualitativ hochwertige gradient Gele sind ein weiterer wichtiger Bestandteil des Protokolls. Vorgefertigte Gele für blaue native Seite sind im Handel erhältlich; jedoch ist es nicht empfohlen, sie zu benutzen, da der Puffer für kommerzielle Gele könnte eine Komposition, die anders als die Probe-Puffer ist. Die Steigung des Gels verwendet hier (6-15 %) ist optimal für die Trennung der einzelnen OXPHOS-Komplexe. Um supramolekularen Strukturen höherer Ordnung des OXPHOS, auch bekannt als Atmungskette Supercomplexes14, zu erkennen ist eine Optimierung erforderlich11.
Für die Visualisierung von OXPHOS verwenden komplexe die spezifischen Antikörper gegenüber dem Vorquartal aufgrund ihrer Eigenschaften. Z. B. zuerst die Antikörper, der das schwächste Signal und der Antikörper mit dem stärksten Signal letzten gibt. Dies ist wichtig, da das Abisolieren die Erkennung (Abbildung 1 schwächt). Die Zusammensetzung der komplexe der Atmungskette untersucht werden kann, wenn das Gel nach BN-Seite der zweiten Dimension SDS-PAGE15unterliegt.
Das hier beschriebene Protokoll schlägt mit Antikörpern gegen einzelne OXPHOS-Komplexe gegenüber dem Vorquartal. Jedoch kann der im Handel erhältliche OXPHOS-Antikörper cocktail verwendet werden, alle fünf OXPHOS-Komplexe gleichzeitig zu erkennen. Dennoch sollte um sein unvollständig montierten OXPHOS-Komplexe erkennen und definieren ihre Identität, Antikörper gegen einzelne OXPHOS-Komplexe nacheinander verwendet werden. Dieser Schritt ist zeitaufwändig. Es kann jedoch wesentlich zum Testen von neuen experimentellen Bedingungen und Modelle.
Die Konzentration von Digitonin verwendet für mitochondriale Isolierung sollte für die bestimmten Zelltyp optimiert werden. Als Reinigungsmittel permeabilizes Digitonin Zellmembranen. Die optimale Konzentration von Digitonin permeabilizes effizient die Plasmamembran der Zellen der mitochondrialen Membranen intakt. Zu geringer Konzentration von Digitonin verursacht hohe Kontamination der mitochondrialen Extrakte, während zu hoher Konzentration der mitochondrialen Membranen schadet und die mitochondriale Gesamtausbeute reduziert. Das optimale Digitonin/Protein-Verhältnis (g/g) variiert von 0,3 bis 1. Western-Blot Analyse von Proteinen aus Pellets und Überstände extrahiert kann verwendet werden, um die optimale Konzentration von Digitonin16zu testen.
Dieses Protokoll enthält keine Ladekontrolle auf der Immunoblot Protein; die Proteinkonzentration der extrahierten komplexe sollte daher, sorgfältig zumindest in Triplicates Gewährleistung gleicher Belastung gemessen werden. Darüber hinaus können die Proben in BN-Seite in Wiederholungen ausgeführt werden. Wenn die Montage der selektiven OXPHOS-Komplexe beeinträchtigt wird, können als Steuerelemente laden unberührt komplexe dienen.
Die Schätzung der molekularen Masse des Protein-komplexe in der BN-Seite ist eine Herausforderung,18. Das aktuelle Protokoll beinhaltet nicht den Molekulargewicht Marker; um die Montage der OXPHOS-Komplexe abschätzen zu können, sollte die Kontrollproben mit unberührt komplexe daher immer in die Analyse einbezogen werden. Die Kontrollproben für BN-Seite sind in der Regel unbehandelt oder wild-Typ-Zellen.
Die hier vorgestellte Methode ist für die Erkennung der mitochondrialen Atmungskette komplexe optimiert; Es kann jedoch auch für die Bewertung der Oligomerisierung von mitochondrialen Proteine19angewendet werden. Darüber hinaus kann die Montage bei OXPHOS-Komplexe durch erste abbauende mitochondrial kodierten Untereinheit enthält komplexe von Chloramphenicol und dann nach ihrer Genesung nach der Entfernung von Chloramphenicol10untersucht werden. BN-Seite ist somit lässt sich stationäre Ebenen und Montage von OXPHOS für verschiedene Anwendungen einschließlich molekulare Diagnostik von menschlichen mitochondrialen Erkrankungen9,11bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Helsinki University Library ist für die finanzielle Unterstützung im Verlagswesen dankte.
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |