Questo protocollo dimostra l’analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide nativo blu. Qui è descritto il metodo applicato alle cellule umane coltivate.
La respirazione mitocondriale viene eseguita dai complessi della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) all’interno dei mitocondri. Fattori interni ed ambientali possono perturbare il montaggio e la stabilità dei complessi della fosforilazione ossidativa. Questo protocollo descrive l’analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) in applicazione alle cellule umane coltivate. In primo luogo, i mitocondri sono estratti dalle cellule utilizzando digitonina, quindi utilizzando lauryl maltoside, i complessi OXPHOS intatti sono isolati dalle membrane mitocondriali. I complessi OXPHOS quindi vengono risolti tramite l’elettroforesi del gel di pendenza in presenza del colorante caricato negativamente, Coomassie blu, che impedisce l’aggregazione proteica e garantisce la mobilità elettroforetica dei complessi della proteina verso il catodo. Infine, i complessi OXPHOS sono rilevati dall’immunoblotting standard. Così, BN-PAGE è una tecnica conveniente ed economica che può essere utilizzata per valutare l’assemblaggio di complessi OXPHOS intere, in contrasto con la base SDS-PAGE, permettendo lo studio di solo singoli OXPHOS complessa unità secondarie.
I mitocondri sono organelli multifunzionali che gioca un ruolo importante nella produzione di energia, regolazione del metabolismo cellulare, segnalazione, apoptosi, invecchiamento, ecc.1,2,3. La produzione di energia nei mitocondri si basa sulla funzione di fosforilazione ossidativa che le coppie di respirazione con sintesi di ATP. Nelle cellule umane, il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è composto da cinque complessi. Complessi I-IV crea un gradiente elettrochimico protonico nello spazio intermembrana mitocondriale che viene utilizzato dal complesso V per produrre ATP. Ogni complesso OXPHOS è multimerici e, tranne II complesso, composto da subunità codificate da geni sia nucleari che mitocondriali. Eventuali difetti nei componenti principali dei complessi OXPHOS causati da mutazioni o stress ambientale possono perturbare l’assemblaggio e la funzionalità del sistema di fosforilazione ossidativa. Inoltre, il corretto assemblaggio dei complessi OXPHOS funzionale richiede un gran numero di assemblaggio fattori4,5,6.
L’elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è una tecnica fondamentale consentendo l’analisi dei complessi della proteina intatto e può essere usato per studiare l’assemblaggio di complessi OXPHOS. In primo luogo, i mitocondri sono isolati dalle cellule di digitonina, che è un detergente delicato che permeabilizes la membrana plasmatica delle cellule. Quindi, utilizzando lauryl maltoside, complessi di OXPHOS vengono rilasciati dalle membrane mitocondriali. Utilizzando l’elettroforesi del gel di pendenza, i complessi OXPHOS sono separati secondo la loro massa. Coomassie blu G-250 (non R-250) aggiunto per la sample buffer e il buffer di catodo blu si dissocia associazioni detergente-labile ma conserva catena respiratoria singoli complessi intatti8. Durante l’elettroforesi, il buffer di catodo blu contenente colorante viene sostituito dal buffer catodo senza tintura, che assicura il trasferimento efficiente dei complessi della fosforilazione ossidativa per la membrana PVDF8. Per visualizzare i complessi di OXPHOS, la membrana PVDF è in sequenza incubata con anticorpi corrispondenti per le subunità selezionate dei cinque complessi OXPHOS.
Il metodo descritto qui con alcune modifiche può essere applicato a qualsiasi cellule coltivate. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l’analisi di complessi OXPHOS in mitocondri isolati da campioni di tessuto9. BN-PAGE richiede almeno 5-10 µ g di mitocondri per ciascun campione per corsa. Utilizzando il metodo descritto qui, 500.000 cellule ad esempio HEK293, SH-SY5Y coltivate o cellule 143B possono produrre circa 10 µ g di mitocondri. Tuttavia, una quantità sufficiente di cellule per l’analisi BN dipende dal tipo specifico delle cellule.
Il metodo più comune per lo studio di proteine mitocondriali OXPHOS è SDS-PAGE e western blotting. Tuttavia, SDS-PAGE permette di studiare solo singole subunità OXPHOS e, in contrasto con BN-PAGE, non può essere utilizzato per valutare l’assemblaggio di complessi OXPHOS intero. Chiara nativo-pagina separa complessi di proteine in condizioni native senza la presenza di colorante caricato negativamente e ha una risoluzione significativamente inferiore rispetto ai BN-PAGE. Tuttavia, chiara nativo-pagina è più mite che BN-PAGE quindi può mantenere il labile assemblaggio supramolecolare dei complessi della proteina come supercomplessi OXPHOS che si dissociano sotto le condizioni di BN-PAGE10. In questo protocollo, il gel di pendenza viene utilizzato per separare i complessi; Tuttavia, in alternativa, separazione di gradiente non può essere utilizzato se il produttore di gradiente relativamente costoso non è disponibili11.
Importante, il metodo qui descritto permette di analizzare l’assemblaggio di complessi OXPHOS, mentre la funzionalità dei complessi non è valutata. Un’alta risoluzione BN-PAGE seguita da attività in gel dosaggio11 , nonché l’analisi spettrofotometrica attività enzimatica dei complessi mitocondriali12 sono tecniche efficienti per l’analisi funzionale dei complessi OXPHOS. Tuttavia, entrambi questi metodi di analisi non l’assemblaggio di complessi OXPHOS.
Così, BN-PAGE è il metodo ottimo per indagare l’assemblaggio dei singoli OXPHOS complessi. Ad esempio, alcune patologie mitocondriali, come la neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON), encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica e colpo-come gli episodi (MELAS), sono associati con montaggio alterato di uno o più componenti della OXPHOS sistema5. Utilizzando il metodo di BN-PAGE descritto qui, possono essere studiati i meccanismi molecolari delle malattie mitocondriali.
Una delle parti più critiche del protocollo è quello di mantenere intatti complessi di OXPHOS durante la preparazione del campione, deposito ed elettroforesi del gel. Così, i mitocondri devono essere isolati a + 4 ° C e i campioni non dovrebbero subire cicli di gelo-disgelo. Complessi di OXPHOS possono tollerare solo un ciclo di gelo-disgelo durante l’intera procedura. Più cicli di gelo-disgelo distruggono complessi OXPHOS (Figura 1B). Controllo e campioni sperimentali che devono essere confrontati dovrebbero essere preparati in parallelo per evitare eventuali differenze nelle condizioni di conservazione, che potrebbero dare risultati fuorvianti. Se non è possibile eseguire tutti i passaggi del protocollo in parallelo con tutti i campioni, si consiglia di congelare palline delle cellule lavate a-80 ° C (passo 1.4 in questo protocollo) e successivamente svolgere il resto del protocollo per tutti i campioni insieme almeno fino al gel elec trophoresis. Particolare attenzione dovrebbe essere rivolta alla pulizia dell’apparato elettroforesi (serbatoio, cassetta). Se l’apparecchio stesso è usato per SDS-PAGE, lavare molto bene prima di BN-PAGE. Qualsiasi residuo SDS può provocare la dissociazione dei complessi OXPHOS durante l’elettroforesi.
Gel di alta qualità gradiente sono un’altra parte fondamentale del protocollo. Gel prefabbricati per PAGE nativo blu sono disponibili in commercio; Tuttavia, non è consigliabile utilizzarli, poiché i buffer utilizzati per gel commerciale potrebbero avere una composizione, che è diversa dai buffer di campione. Il gradiente del gel utilizzato qui (6-15%) è ottimo per la separazione dei singoli complessi OXPHOS. Per rilevare strutture supramolecolari di ordine superiore di OXPHOS, noto anche come respiratoire supercomplessi14, alcune ottimizzazione è richiesto11.
Per la visualizzazione di OXPHOS complessi utilizzano anticorpi specifici in sequenza, in base alle loro proprietà. Ad esempio, utilizzare innanzitutto l’anticorpo che dà il segnale più debole e l’anticorpo con il segnale più forte Ultima. Ciò è importante poiché lo stripping indebolisce la rilevazione (Figura 1). La composizione dei complessi della catena respiratoria può essere studiata se dopo BN-PAGE gel viene sottoposto per la seconda dimensione SDS-PAGE15.
Il protocollo descritto qui suggerisce usando gli anticorpi contro i singoli complessi di OXPHOS in sequenza. Tuttavia, l’anticorpo OXPHOS commercialmente disponibile cocktail consente di rilevare contemporaneamente tutti e cinque i complessi OXPHOS. Tuttavia, per essere in grado di rilevare in modo incompleto assemblato OXPHOS complessi e definire la loro identità, anticorpi contro i complessi di OXPHOS individuali dovrebbero essere usati in sequenza. Questo passaggio è che richiede tempo; Tuttavia, può essere essenziale per la sperimentazione di modelli e nuove condizioni sperimentali.
La concentrazione di digitonina utilizzata per isolamento mitocondriale dovrebbe essere ottimizzata per il tipo di cella specifica. Come detergente, digitonina permeabilizes membrane cellulari. La concentrazione ottimale di digitonina permeabilizes efficacemente la membrana plasmatica delle cellule lasciando intatte le membrane mitocondriali. Concentrazione troppo bassa di digitonina causa elevata contaminazione degli estratti mitocondriali mentre concentrazione troppo elevata danneggia le membrane mitocondriali e riduce la resa totale mitocondriale. Il rapporto ottimale della digitonina/proteine (g/g) varia da 0,3 a 1. Analisi di Western blot di proteine estratte da surnatanti e pellet può essere utilizzato per testare la concentrazione ottimale di digitonina16.
Questo protocollo non include proteine caricamento controllo su immunoblot; di conseguenza, la concentrazione nella proteina di estratti complessi dovrebbe essere attentamente misurata almeno in triplici copie per garantire uguale carico. Inoltre, i campioni possono essere eseguiti in BN-PAGE in replicati. Se l’assemblaggio di complessi OXPHOS selettive è alterata, inalterati complessi possono servire come controlli di caricamento.
La stima della massa molecolare dei complessi proteici in BN-PAGE è impegnativo18. Il protocollo corrente non include il marcatore di peso molecolare; Pertanto, per stimare l’assemblaggio dei complessi OXPHOS, i campioni di controllo contenenti complessi inalterati dovrebbero sempre essere inclusi nell’analisi. I campioni di controllo per BN-PAGE sono di solito cellule di tipo non trattata o selvatici.
Il metodo qui presentato è ottimizzato per la rilevazione dei complessi della catena respiratoria mitocondriale; Tuttavia, può anche essere applicato per la valutazione dell’oligomerizzazione di proteine mitocondriali19. Inoltre, il tasso di assemblaggio dei complessi OXPHOS può essere studiato prima subunità mitocondriale codificato che esaurisce i complessi contenenti cloramfenicolo e seguendo le loro recupero dopo la rimozione del cloramfenicolo10. Così, BN-PAGE può essere utilizzato per valutare i livelli allo stato stazionario e l’assemblaggio di OXPHOS per diverse applicazioni tra cui diagnostica molecolare delle malattie mitocondriali umane9,11.
The authors have nothing to disclose.
Biblioteca dell’Università di Helsinki è ringraziato per il sostegno finanziario nell’editoria.
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |