تحليل Mitochondrial مجمعات سلسلة التنفس في "الخلايا البشرية المزروعة" استخدام التفريد جل Polyacrylamide الأصلي الأزرق وإيمونوبلوتينج
Summary
هذا البروتوكول يوضح تحليل سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات بالتفريد زرقاء هلام polyacrylamide الأصلية. ويرد هنا طريقة تطبيقها على الخلايا البشرية المزروعة.
Abstract
ويقوم التنفس المتقدرية بالمجمعات الفسفرة (أوكسفوس) داخل الميتوكوندريا. يمكن التشويش العوامل الداخلية والبيئية في الجمعية واستقرار المجمعات أوكسفوس. يصف هذا البروتوكول تحليل سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات بالتفريد جل polyacrylamide الأصلي الأزرق (BN-الصفحة) في التطبيق على الخلايا البشرية المزروعة. أولاً، يتم استخراج الميتوكوندريا من الخلايا باستخدام ديجيتونين، ثم استخدام مالتوسيدي دوديسيل، مجمعات أوكسفوس سليمة يتم عزل من أغشية الميتوكوندريا. ثم يتم حل مجمعات أوكسفوس بالتفريد جل التدرج حضور صبغ مشحونة سلبا، أخذ الأزرق، الذي يمنع تجميع البروتين ويضمن التنقل الغرواني الكهربي للبروتين المجمعات نحو الكاثود. وأخيراً، يتم الكشف عن مجمعات أوكسفوس قبل إيمونوبلوتينج القياسية. وهكذا، هو BN-صفحة تقنية مريحة وغير مكلفة التي يمكن استخدامها لتقييم الجمعية العامة مجمعات أوكسفوس كامل، على النقيض من الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة الأساسية يتيح دراسة فقط الفردية أوكسفوس مفارز المعقدة.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات المتعددة الوظائف التي تلعب دوراً هاما في إنتاج الطاقة، وتنظيم الأيض الخلوية، إشارات، المبرمج، الشيخوخة، إلخ1،،من23. يعتمد إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا على الدالة الفسفرة الأزواج التنفس مع توليف ATP. في الخلايا البشرية، يتألف نظام الفسفرة المتقدرية (أوكسفوس) من المجمعات الخمسة. إنشاء مجمعات من الأول إلى الرابع تدرج بروتون الكهروكيميائية في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا التي تستخدمها الخامس مجمع لإنتاج ATP. كل أوكسفوس المعقدة مولتيميريك، وما عدا الثاني معقدة، تتألف من الوحدات الفرعية مرمزة بواسطة المورثات النووية سواء المتقدرية. أي عيوب في المكونات الأساسية لمجمعات أوكسفوس بسبب الطفرات أو الإجهاد البيئي يمكن التشويش على الجمعية ووظائف النظام الفسفرة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب الجمعية المناسب الوظيفي أوكسفوس مجمعات عددا كبيرا من الجمعية العوامل4،،من56.
هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) هو أسلوب أساسي تمكين تحليل البروتين سليمة المجمعات ويمكن استخدامها لدراسة الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس. أولاً، الميتوكوندريا معزولة من الخلايا التي ديجيتونين، وهو خفيف منظفات التي بيرميبيليزيس غشاء البلازما للخلايا. ثم، باستخدام مالتوسيدي سولفات، يتم إطلاق سراح مجمعات أوكسفوس من أغشية الميتوكوندريا. باستخدام التفريد جل التدرج، يتم فصل مجمعات أوكسفوس حسب كتلتها. أخذ G-250 الأزرق (لا R-250) إضافة إلى المخزن المؤقت عينة والمخزن المؤقت كاثود الأزرق تنأى بالجمعيات المنظفات مجا ولكن يحافظ على سلسلة التنفس فرادى مجمعات سليمة8. أثناء التفريد، يتم استبدال كاثود الأزرق المخزن المؤقت الذي يحتوي على صبغ الكاثود المخزن المؤقت دون صباغة، مما يضمن كفاءة نقل مجمعات أوكسفوس ل الغشاء PVDF8. تصور مجمعات أوكسفوس، هو الغشاء PVDF المحتضنة تسلسلياً مع الأجسام المضادة المقابلة للوحدات الفرعية المحددة من المجمعات أوكسفوس الخمسة.
يمكن تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا مع بعض التعديلات لأي الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحليل مجمعات أوكسفوس في الميتوكوندريا المعزولة من عينات الأنسجة9. BN-الصفحة يتطلب على الأقل 5-10 ميكروغرام من الميتوكوندريا لكل عينة في تشغيل. باستخدام الطريقة الموضحة هنا، 500,000 مثقف خلايا مثل HEK293، SH SY5Y أو يمكن أن تسفر عن الخلايا 143B حوالي 10 ميكروغرام من الميتوكوندريا. ومع ذلك، كمية كافية من الخلايا لتحليل BN يعتمد على نوع الخلية المحددة.
هو الأسلوب الأكثر شيوعاً لدراسة الميتوكوندريا أوكسفوس البروتينات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية. بيد أن الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تتيح دراسة فقط مفارز أوكسفوس الفردية وخلافا لصفحة الجبهة الوطنية، لا يمكن استخدامها لتقييم الجمعية بأكملها أوكسفوس المجمعات. صفحة أصلي واضح يفصل البروتين المجمعات في الشروط الأصلية دون الوجود صبغ مشحونة سلبا وقد حل أقل بكثير بالمقارنة مع BN-الصفحة. بيد أن الصفحة الأصلية واضحة أكثر اعتدالا من BN-الصفحة حيث أنه يمكن الاحتفاظ بالجمعيات سوبراموليكولار مجا مجمعات البروتين مثل سوبيركومبليكسيس أوكسفوس التي يتم فصلها تحت ظروف BN-الصفحة10. في هذا البروتوكول، يتم استخدام هلام التدرج لفصل المجمعات؛ ومع ذلك، بدلاً من ذلك، فصل غير التدرج يمكن استخدامها إذا لم يكن صانع التدرج مكلفة نسبيا المتاحة11.
المهم، الأسلوب الموصوفة هنا يسمح تحليل الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس، في حين لا يتم تقييم الأداء الوظيفي للمجمعات. صفحة BN الاستبانة تليها في جل نشاط الإنزيم11 فضلا عن مقايسة النشاط الأنزيمي سبيكتروفوتوميتريك المجمعات المتقدرية12 تقنيات فعالة للتحليل الوظيفي من المجمعات أوكسفوس. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب لا الاعتداء الجمعية العامة للمجمعات أوكسفوس.
وهكذا، BN-الصفحة هو الأسلوب الأمثل للتحقيق في الجمعية العامة مجمعات أوكسفوس الفردية. على سبيل المثال، بعض الاضطرابات الميتوكوندريا، مثل يبر وراثية الألياف البصرية الاعتلال العصبي (لون)، اعتلال الدماغ الميتوكوندريا مع الحماض اللبن والسكتة الدماغية مثل الحلقات (ميلس)، ترتبط مع الجمعية غيرت من مكون واحد أو أكثر من أوكسفوس 5من النظام. باستخدام الأسلوب BN-الصفحة الموصوفة هنا، يمكن دراسة الآليات الجزيئية لأمراض الميتوكوندريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من أهم أجزاء من البروتوكول هو الحفاظ على مجمعات أوكسفوس سليمة أثناء إعداد عينة، التخزين وهلام التفريد. وهكذا، ينبغي أن الميتوكوندريا المعزولة في + 4 درجة مئوية والعينات يجب أن لا تخضع لدورات تجميد أذاب. يمكن أن تتسامح مجمعات أوكسفوس سوى دورة واحدة من دورات تجميد أذاب أثناء الإجراء بأكمله. عدة دورات تجميد أذاب تدمير مجمعات أوكسفوس (الشكل 1B). وينبغي إعداد التحكم والعينات التجريبية التي يمكن مقارنتها بالتوازي لتجنب أي خلافات في ظروف التخزين، والتي قد تعطي نتائج مضللة. إذا كان من غير الممكن القيام بجميع الخطوات للبروتوكول بالتوازي مع جميع العينات، نوصي بتجميد الكريات خلية غسلها في-80 درجة مئوية (الخطوة 1، 4 في هذا البروتوكول)، وبعد القيام ببقية البروتوكول لجميع العينات معا على الأقل حتى انتخابات هلام تروفوريسيس. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لنظافة جهاز التفريد (الدبابات، كاسيت). إذا تم استخدام نفس الجهاز للحزب الديمقراطي الصربي صفحة، تغسل جيدا قبل BN-الصفحة. يمكن أن يسبب أي المخزونات المتبقية الانفصال المجمعات أوكسفوس أثناء التفريد.
المواد الهلامية المتدرجة عالية الجودة جزء أساسي آخر من البروتوكول. المواد الهلامية الخرسانة الجاهزة للصفحة الأصلية الزرقاء متوفرة تجارياً؛ ومع ذلك، لا ينصح للاستفادة منها، ونظرا للمخازن المؤقتة المستخدمة للمواد الهلامية التجارية قد يكون تكوين، الذي يختلف عن نموذج المخازن المؤقتة. تدرج جل المستخدمة هنا (6-15 ٪) الأمثل للفصل بين الفردية أوكسفوس المجمعات. للكشف عن هياكل supramolecular مرتبة أعلى من أوكسفوس، سلسلة التنفس المعروف أيضا سوبيركومبليكسيس14، هو بعض التحسين المطلوب11.
لتصور أوكسفوس المجمعات استخدام أجسام مضادة محددة التتابع، استناداً إلى خصائصها. على سبيل المثال، استخدم أولاً جسم يعطي إشارة أضعف والجسم مع أقوى إشارة آخر. وهذا أمر مهم حيث تعرية يضعف في الكشف عن (الشكل 1). يمكن أن يحقق تكوين مجمعات سلسلة التنفس إذا بعد BN-صفحة تعرض الهلام للبعد الثاني الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة15.
البروتوكول هو موضح هنا تشير إلى استخدام الأجسام المضادة ضد مجمعات أوكسفوس الفردية تسلسلياً. ومع ذلك، يمكن استخدامها جسم أوكسفوس المتاحة تجارياً كوكتيل للكشف عن جميع مجمعات أوكسفوس خمسة في وقت واحد. ومع ذلك، لتكون قادرة على كشف مجمع بشكل كامل أوكسفوس المجمعات وتحديد هويتهم، الأجسام المضادة ضد مجمعات أوكسفوس الفردية ينبغي أن تستخدم تسلسلياً. هذه الخطوة مضيعة للوقت؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون ضرورية لاختبار شروط تجريبية جديدة ونماذج.
ينبغي أن يكون الأمثل تركيز ديجيتونين المستخدمة لعزل المتقدرية لنوع الخلية المحددة. كمطهر، بيرميبيليزيس ديجيتونين أغشية الخلية. كفاءة بيرميبيليزيس تركيز الأمثل ديجيتونين غشاء البلازما الخلايا المساس باغشية الميتوكوندريا. تركيز منخفض جداً من ديجيتونين يسبب التلوث عالية مقتطفات mitochondrial بينما التركيز العالي جداً الأضرار أغشية الميتوكوندريا ويقلل من إجمالي العائد المتقدرية. نسبة الأمثل ديجيتونين/البروتين (g/g) يختلف من 0.3 إلى 1. يمكن استخدام تحليل لطخة غربية للبروتينات المستخرجة من الكريات وسوبيرناتانتس لاختبار تركيز الأمثل ديجيتونين16.
هذا البروتوكول لا يشمل البروتين تحميل عنصر التحكم في إيمونوبلوت؛ ولذلك، تركيز البروتين المستخرج من المجمعات يجب بعناية تقاس على الأقل في تريبليكاتيس لضمان تحميل متساوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تشغيل العينات في صفحة الجبهة الوطنية في replicates. وإذا كانت الجمعية انتقائية أوكسفوس مجمعات البصر، يمكن أن تكون مجمعات لا تتأثر تحميل عناصر التحكم.
تحدي تقدير الكتلة الجزيئية للبروتين المجمعات في الجبهة الوطنية-الصفحة18. ولا يشمل البروتوكول الحالي علامة الوزن الجزيئي؛ ولذلك، لتقدير الجمعية لمجمعات أوكسفوس، عينات التحكم تحتوي على مجمعات لا تتأثر ينبغي دائماً إدراج في التحليل. عادة ما تكون عينات مراقبة BN-صفحة الخلايا غير المعالجة أو البرية من نوع.
الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل للكشف عن سلسلة التنفس المتقدرية المجمعات؛ ومع ذلك، يمكن تطبيقها لتقييم أوليجوميريزيشن للبروتينات المتقدرية19أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة معدل الجمعية مجمعات أوكسفوس بأول المستنفدة لطبقة فرعية المتقدرية ترميز المجمعات التي تحتوي على الكلورامفينيكول وثم بعد شفائهم بعد إزالة الكلورامفينيكول10. وهكذا، يمكن استخدام BN-صفحة لتقييم مستويات مستقرة وجمعية أوكسفوس لمختلف التطبيقات بما في ذلك التشخيص الجزيئي لاضطرابات المتقدرية البشرية9،11.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مكتبة جامعة هلسنكي هو عن شكره للدعم المالي في مجال النشر.
Materials
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
Riferimenti
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T. The role of mitochondria in aging. The Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3662-3670 (2018).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .. C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y. ARF in the mitochondria: the last frontier?. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 7 (23), 3641-3646 (2008).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
