该方案通过蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳对线粒体呼吸链配合物进行了分析。这里介绍了应用于培养的人体细胞的方法。
线粒体呼吸是由线粒体内的氧化磷酸化 (oxphos) 复合物进行的。内部和环境因素会干扰 oxphos 配合物的组装和稳定性。该协议描述了用蓝色原代聚丙烯酰胺凝胶电泳 (bn-page) 分析线粒体呼吸链复合物在培养的人体细胞中的应用。首先, 线粒体是用数字素从细胞中提取的, 然后使用月桂基麦芽苷, 完整的 oxphos 复合物从线粒体膜中分离出来。然后在负电荷染料 Coomassie 存在的情况下, 通过梯度凝胶电泳来解析 oxphos 复合物, 该染料可防止蛋白质聚集, 并确保蛋白质配合物向阴极的电泳迁移。最后, 用标准免疫印迹法检测 oxphos 复合物。因此, bn-page 是一种方便且廉价的技术, 可用于评估整个 oxphos 复合物的组装, 而基本的 sds-page 只允许对单个 oxphos 复合体进行研究。
线粒体是一种多功能细胞器, 在能量产生、调节细胞代谢、信号转导、凋亡、衰老等方面发挥着重要作用。线粒体的能量产生依赖于将呼吸与 atp 合成结合的氧化磷酸化功能。在人体细胞中, 线粒体氧化磷酸化系统 (oxphos) 由五个复合物组成。复合物 i-iv 在线粒体膜间空间中创建一个电化学质子梯度, 由复合体 v 用于产生 atp。每个 oxphos 复合体都是多色的, 除了复合体 ii 外, 由核基因和线粒体基因编码的亚基组成。oxphos 复合物的核心成分中的任何缺陷都会引起突变或环境压力, 从而干扰氧化磷酸化系统的组装和功能。此外, 功能 oxphos 复合物的正确组装需要大量的装配因子4、5、6。
蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳 (bn-page) 是一项基本技术, 能够分析完整的蛋白质复合物, 并可用于研究 oxphos 复合物的组装。首先, 线粒体是通过数字素从细胞中分离出来的, 一种温和的洗涤剂, 能渗透细胞的质膜。然后, 通过使用月桂基麦芽苷, oxphos 配合物从线粒体膜中释放出来。利用梯度凝胶电泳, 根据 oxphos 配合物的质量对其进行分离。coomassie 蓝色的 g-250 (而不是 r-250) 添加到样品缓冲液和蓝色阴极缓冲液中, 使洗涤剂不稳定的关联, 但保持单个呼吸链复合物完整8。在电泳过程中, 含染料的蓝色阴极缓冲液被无染料的阴极缓冲液所取代, 从而确保了 oxphos 配合物有效地转移到 pvdf 膜8。为了可视化 oxphos 复合物, pvdf 膜按顺序与五个 oxphos 配合物的选定亚基相对应的抗体孵育。
这里描述的方法, 经过一些修改, 可以应用于任何培养的细胞。此外, 该方法还可用于分析从组织样本9中分离出的线粒体中的 oxphos 复合物.bn-page 每次运行至少需要5-10 微克的线粒体。使用这里描述的方法, 500, 000个培养细胞, 如 hek293、sh-sy5y 或143b 细胞, 可以产生约10微克的线粒体。但是, 用于 bn 分析的足够数量的单元格取决于特定的细胞类型。
研究线粒体 oxphos 蛋白最常用的方法是 sds-page 和西方印迹。但是, sds-page 只允许研究单个 oxphos 子单元, 与 bn-page 不同的是, 不能用于评估整个 oxphos 复合体的组装。在没有负电荷染料存在的情况下, 清除本机页分离蛋白质复合物, 其分辨率明显低于 bn-page。然而, 清晰的本机页比 bn-page 温和, 因此它可以保留蛋白质复合物的不稳定的超分子组合, 如在 bn-page 条件下离解的 oxphos 超复合物。在该协议中, 梯度凝胶用于分离复合物;但是, 或者, 如果相对昂贵的梯度制造商不可用, 则可以使用非梯度分离 11。
重要的是, 此处描述的方法允许分析 oxphos 复合物的组装, 而不评估复合物的功能。采用高分辨率 bn-page, 然后通过凝胶活性测定11以及线粒体复合物12的分光光度酶活性测定, 是对 oxphos 复合物进行功能分析的有效技术.然而, 这两种方法都不能测定 oxphos 复合物的组装。
因此, bn-page 是研究单个 oxphos 复合物组装的最佳方法。例如, 一些线粒体疾病, 如 leber 遗传性视神经病变 (lhon)、线粒体脑病和乳酸酸中毒和中风样发作 (melas), 与 oxphos 的一个或多个成分组装改变有关系统5。利用本文介绍的 bn-page 方法, 可以研究线粒体疾病的分子机制。
该协议最关键的部分之一是在样品制备、储存和凝胶电泳过程中保持完整的 oxphos 复合物。因此, 线粒体应在 + 4°c 时分离, 样品不应经历冻融循环。oxphos 配合物在整个过程中只能承受一个冻融循环。多个冻融循环破坏 oxphos 复合物 (图 1 b)。要比较的控制和实验样本应同时准备, 以避免储存条件的任何差异, 这可能会产生误导的结果。如果不可能与所有样品并行执行协议的所有步骤, 我们建议将清洗过的细胞颗粒冻结在-80°c (本协议中的步骤 1.4), 然后至少对所有样品进行协议的其余部分, 直到凝胶营养病。应特别注意电泳装置 (储罐、盒式磁带) 的清洁度。如果 sds-page 使用相同的设备, 请在 bn-page 之前非常好地清洗它。任何残留的 sds 都会在电泳过程中导致 oxphos 配合物的离解。
高质量的梯度凝胶是协议的另一个关键部分。用于蓝色原生 page 的预制凝胶可在市场上买到;但是, 不建议使用它们, 因为用于商业凝胶的缓冲区可能具有与示例缓冲区不同的组合。这里使用的凝胶梯度 (6-15) 是分离单个 oxphos 复合物的最佳选择。为了检测 oxphos (也称为呼吸链超复合物14) 的高阶超分子结构, 需要进行一些优化。
对于 oxphos 复合物的可视化, 根据其特性, 按顺序使用特定抗体。例如, 首先使用给出最弱信号的抗体, 最后使用信号最强的抗体。这一点很重要, 因为剥离会削弱检测 (图 1d)。如果 bn-page 之后凝胶受到二维 sds-page 15 的影响, 则可以研究呼吸链复合物的组成.
这里描述的协议建议对单个 oxphos 复合物依次使用抗体。然而, 市售的 oxphos 抗体鸡尾酒可用于同时检测所有五种 oxphos 复合物。然而, 为了能够检测到不完全组装的 oxphos 复合物并确定其同一性, 应按顺序使用针对单个 oxphos 复合物的抗体。此步骤非常耗时;然而, 它可能是测试新的实验条件和模型的必要条件。
用于线粒体分离的数字素浓度应针对特定细胞类型进行优化。作为洗涤剂, 数字素对细胞膜具有渗透性。数字蛋白的最佳浓度有效地渗透细胞的质膜, 使线粒体膜保持完整。过高的超位素浓度会导致线粒体提取物的高污染, 而过高的浓度会损害线粒体膜, 并降低线粒体的总产量。最佳的数蛋白比 (g/g) 从0.3 到1不等。西方对从颗粒和上清液中提取的蛋白质进行印迹分析, 可用于检测数字蛋白16的最佳浓度。
该方案不包括免疫印迹的蛋白质负载控制;因此, 提取的复合物的蛋白质浓度应仔细测量至少在三元组, 以确保相等的负荷。此外, 还可以在复制的 bn-page 中运行示例。如果选择性 oxphos 配合物的组装受到损害, 未受影响的配合物可以作为加载控制。
对 bn-page 中蛋白质复合物分子质量的估计具有挑战性18。目前的协议不包括分子量标记;因此, 为了估计 oxphos 复合物的组装, 应始终将含有未受影响的复合物的控制样本纳入分析。bn-page 的对照样本通常是未经处理或野生类型的细胞。
本文提出的检测线粒体呼吸链复合物的方法进行了优化;然而, 它也可用于线粒体蛋白的低聚评价 19.此外, 通过先用氯霉素消耗含有复合物的线粒体编码亚基, 然后在去除氯霉素10后进行回收, 可以研究 oxphos 配合物的组装率。因此, bn-page 可用于评估 oxphos 的稳态水平和组装, 用于不同的应用, 包括人类线粒体疾病的分子诊断9,11。
The authors have nothing to disclose.
感谢赫尔辛基大学图书馆在出版方面提供的财政支持。
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |