ICP0는 HSV-1 감염 중 핵-세포질 전을 겪 습. 이 이벤트의 분자 메커니즘은 알 수 없습니다. 여기는 HSV-1 감염, 양적 분석 ICP0 전 미래 기계 론 적인 연구에 대 한 기초를 낳는 ICP0 운동 척도를 도구로 confocal 현미경의 사용에 설명 합니다.
포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1)의 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0) 링 타입 E3 유비퀴틴 리가 포함 하는 즉시 초기 단백질이입니다. 그것은 호스트 제한 요인 및 후속 바이러스 유전자 활성화 proteasomal 저하에 대 한 책임입니다. ICP0 정식 핵 지 방화 순서를 (NLS)에 포함 되어 있습니다. 그것은 합성 드 노 보 직후 핵을 입력 하 고 핵에 주로 그 반대로 호스트 방어 기능을 실행. 그러나, 나중에 감염, ICP0에서에서 발견 된다 전적으로 세포질, 핵-세포질 전 HSV-1 감염 시의 발생을 제안. 아마도 ICP0 전 다른 감염 단계에서의 subcellular 위치 그것의 기능을 조절 하는 ICP0 수 있습니다. 생물 학적 기능 및 규제 메커니즘 ICP0 핵-세포질 전 좌의 윤곽을 그리 다, 위해 우리는 HSV-1 감염 시 ICP0 매매 모니터링 하는 immunofluorescent 현미경 검사 법 방법 수정. 이 프로토콜 immunofluorescent 얼룩, confocal 현미경 이미징, 그리고 핵 및 세포질 배급 분석을 포함 한다. 이 프로토콜의 목표는 정상 상태 confocal 이미지가 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 운동의 양적 문서로 시간 코스에 적응. 우리가 제안 하는이 방법은 양적 라이브 이미징 기술을 사용 하지 않고도 다른 바이러스 또는 세포질 단백질의 핵 및 세포질 지역화 분석에 일반화 될 수 있다.
포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1) 다양 한 포진 labialis, 생식 기 포진, 각 막 실질 염, 뇌염 등 심각한 herpetic 질병에 약한 원인. 일단 감염, 바이러스는 중추 신경에 평생 잠복 감염을 설정 합니다. 때때로, 바이러스 열 병, 스트레스, 면역 억제1, 재발 성 헤 르 페 스 감염에 지도 등 다양 한 이유로 다시 활성화 될 수 있습니다. 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0)는 주요 바이러스 레 귤 레이 터 모두 용균성 및 잠재 HSV-1 감염에 대 한 중요 한 이다. 그것은 다운스트림 바이러스 유전자를 통해 counteracting 호스트 내장/타고 난 항 바이러스 방어2,3transactivates. ICP0는 E3 유비퀴틴 리가 활동을, 프로테아좀 종속 저하3에 대 한 몇 가지 셀 요소를 대상으로 하고있다. 그것은 또한 그들의 활동을 규제 하 고 이후에 호스트 항 바이러스 제한3오프셋 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. ICP0는 감염 진행3,,45다른 subcellular 구획에서 찾을 알려져 있다. 단백질은 잔류물 500 5066에 위치한 리/아르기닌 풍부한 핵 지 방화 신호 (NLS) 있다. 초기 HSV-1 감염에 드 노 보 합성 시 ICP0 핵으로 즉시 가져옵니다. 처음 감지 동적 핵에 구조 나 핵 도메인 10 (ND10)7. 유비퀴틴 E3 리가 활동 ICP0 ND10 주최자 단백질, promyelocytic 백혈병 (PML) 단백질 및 단백질 얼룩 덜 룩 한 100 kDa (Sp100)8,,910의 저하를 트리거합니다. 주최자 단백질의 손실 후에 ND10 핵 시체는 분산 하 고 ICP0 전체 핵4,11을 채우기 위해 확산.
흥미롭게도, 바이러스 성 DNA 복제의 개시 후 ICP0는 핵에서 사라집니다. 그것은 전적으로 HSV-1 감염4,12에 핵-세포질 전 좌의 발생을 제안 하는 세포질에서 발견 된다. DNA 복제의 요구는 HSV-1 ICP04,12의 세포질 전 촉진에 늦게 바이러스 성 protein(s)의 잠재적인 참여를 의미 합니다. 분명히 공간 일시적인 패션에 다양 한 세포질 통로에 그것의 상호 작용을 조절 하는 ICP0 힘을 실어주 고 ICP0 감염 시 다른 구획 사이에서 매매 하 고 따라서 좌표 벌금의 여러 기능 사이의 균형 조정 용균성 및 잠재 HSV-1 감염13. 더 나은 이해 ICP0 많은 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 기능 도메인의 조정, 하 우리는 신중 하 게 동적 ICP0 전12의 분자 기초 해 부. 기계 연구 이전에 보고 된12를 실시, 우리 confocal 현미경 다른 감염 상태에서 ICP0 subcellular 지 방화를 시각화 하는 immunofluorescent 착 방법을 적용 했습니다. 우리는 또한 핵 및 세포질 배급 ICP0의 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하는 양적 프로토콜을 개발 했습니다. HSV-1에 감염 된 세포의 인구는 감염 단계에 걸쳐 표로 하 고 다른 생 화 확 적인 치료12에서 ICP0 운동의 동향을 분석 했다. 여기 우리는 상세한 프로토콜 감염 HSV-1에에서는 문서 ICP0 전 좌를 설명합니다. 이 메서드는 핵 및 세포질 전 라이브 이미징 기법으로 인해 적용 되지 않습니다 때 라이브 이미징 하는 대신 봉사 할 수 있는 다른 바이러스 또는 세포질 단백질에 대 한 공부를 하는 일반적인 방법으로 채택 될 수 있는 제안 방법, 신호 강도, 또는 단백질 풍부 라벨 같은 문제.
이 프로토콜은 HSV-1 ICP0의 핵-세포질 전 공부에 사용 되었습니다. ICP0는 HSV-1 감염 (그림 1) 동안 subcellular 밀매를 겪 습. 아마, ICP0 다른 위치에서 다른 기능을 수행 하기 위해 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. 미세 조정 인간의 호스트13투쟁에서의 여러 기능을 ICP0 수 있습니다. 그러나, ICP0 공간 일시적인 방식 다중 기능을 조정 하는 방법 안 되어 잘 공부 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 금융 지원을 해 서울에 게 수 여 하는 NIH 보조금 (RO1AI118992) 감사 합니다. 우리는 기술 지원에 대 한 웨인 주립 대학에서 현미경, 이미징 & Cytometry 리소스 (MICR) 핵심 시설을 감사합니다.
Cells and viruses | |||
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
Medium | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
Reagents | |||
4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
Horse Serum | Sigma | H1270 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
Nail Polish | Sally Hansen | ||
Equipment | |||
Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
Excel software | Microsoft Excel | ||
HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |